不同实验技术在多发性骨髓瘤诊断中的应用价值

周 媛, 陶林静

(南阳市中心医院检验科,河南 南阳 473000)

作为常见血液系统恶性肿瘤,多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者的主要特征为骨髓中恶性浆细胞发生异常增生、聚集,临床多表现为骨质破坏、胸痛、贫血及感染等,并无特异性,极易导致误诊、漏诊[1]。现阶段,骨髓形态学是临床诊断MM的常用方法,通过观察单克隆免疫球蛋白表达及骨性骨质破坏情况来判断,但难以区分部分情况良好的浆细胞和正常细胞形态学,且存在一定的主观性,临床诊断较为困难[2]。免疫组化根据原抗体特异性结合的原理,可有效提高诊断准确性,辨别良恶性及疾病的严重程度[3]。流式细胞术(flow cytometry,FCM)结合力分子生物学、生物学、单克隆抗体激光技术及分子免疫学,可进行多个物理化学参数的检测,特异性高,可准确判断目标将细胞群的单克隆性,可用于检测肿瘤性浆细胞的残留[4]。这些诊断方法均具有各自优劣势,基于此,本研究选取了78例MM患者,将重点观察形态学、免疫组化及FCM在MM中的诊断价值,报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料 回顾性分析2020年1月—2021年12月南阳市人民医院诊治的78例MM患者临床资料。其中男48例,女30例;国际分期体系(international staging system,ISS)分期:Ⅲ期7例,Ⅱ期38例,Ⅰ期33例;年龄41～79(59.37±5.62)岁;免疫球蛋白分型:IgG型42例,IgA型22例,轻链型8例,不分泌型6例。纳入标准:符合MM的诊断标准[5];均接受FCM、形态学及免疫组化检测;资料完整。排除标准:存在急性感染性疾病;合并其他恶性肿瘤;有既往精神病史或认知功能障碍。

1.2 方法

1.2.1 取材方法 常规骨髓穿刺,抽取骨髓液(0.2 mL)涂片,进行形态学及免疫组化检查,抽取骨髓液(2 mL),放于肝素抗凝管,行FCM检测。

1.2.2 形态学观察 选择染色清晰、制作良好,并可鉴定细胞核和细胞质的形态特征骨髓涂片,行瑞氏-吉姆萨染色,显微镜分类,计数200个有核细胞,浆细胞≥20%,且出现形态异常为MM判断标准。

1.2.3 FCM 采用FACS-Calibur流式细胞仪(美国BD公司),获取20 000个细胞,标记细胞表面抗原、细胞内抗原,对数取样,通过CD45/CD138设门,设定待检细胞群,目的细胞群的抗原表达>10%为MM阳性判断标准。

1.2.4 免疫组化 采用直接标记法进行骨髓细胞染色;阳性判断标准为:低倍镜下选择涂片(薄厚适中、均匀、抗原表达显著),高倍镜下细胞核、细胞质或细胞膜均表现为棕黄色均匀颗粒,CD138阳性及lambda阳性在胞浆、胞膜,Kappa阳性在胞浆;阴性表达为不显色或浅淡,显微镜镜下计数核细胞200个,各抗体阳性细胞所占百分比>10%为阳性。试剂盒均购于珠海贝索生物技术有限公司。

1.2.5 观察指标 统计形态学、免疫组化及FCM阳性检测结果并比较;观察FCM、免疫组化检测MM异常浆细胞抗原表达情况(lambda、CD38、Kappa、CD138、CD45及CD19);对FCM、免疫组化及形态学检测异常细胞群占比进行比较。

2 结果

2.1 形态学检查结果 78例MM患者,经形态学检查显示,存在不同程度的免疫球蛋白增加及正色素性贫血,浆细胞异常增生。

2.2 免疫组化、FCM检查结果 78例MM患者经免疫组化检查显示,CD138阳性表达率为100.00%,Kappa、Lambda阳性表达率分别为71.78%、25.64%。经FCM检查显示,CD38、CD138阳性表达均为100.00%,CD45表达异常。见表1。

表1 免疫组化、FCM检查在MM异常浆细胞抗原的表达

表2 免疫组化、FCM检测MM阳性情况

2.4 形态学、免疫组化、FCM检测异常细胞群比较 形态学检查骨髓瘤细胞占比为(59.82±6.73)%;免疫组化检查骨髓瘤细胞占比为(34.67±5.62)%;FCM检查骨髓瘤细胞占比为(36.22±6.74)%。形态学检查骨髓瘤细胞占比高于免疫组化、FCM检查,差异有统计学意义(F=380.063,P<0.001)。免疫组化、FCM检查骨髓细胞瘤占比差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

MM是恶性免疫分泌异常性疾病常见类型,主要因骨髓中的浆细胞异常增生、单克隆免疫球蛋白分泌过度所致。据有关流行病学研究[6]显示,该疾病在所有恶性肿瘤中占比约为1%,在所有血液恶性肿瘤中占比在13%左右,全球每年新发MM病例可达86 000例。MM患者临床表现复杂,起病情况各不相同,且缺乏特异性,有较高的误诊率[6]。随着国际骨髓瘤工作小组对MM诊断标准的进一步更新,使得MM的诊断也更加精细化,其重要性也逐渐得到人们的认可。临床可用于MM诊断的方法较多,传统采用血清学检测,通过实施血清蛋白电泳和免疫固定电泳(SPEP/IFE)及轻链检测,能够在大部分患者检测出单克隆蛋白。但是在采用该方法时,还需辅助应用其他方法来确定疾病状态。虽然24 h尿SPEP/IFE在MM患者的疾病监测过程中具有一定作用,但是该实验方法相对较为繁琐,且标本采集方面不完备,检验结果可靠性较低。因此,随着现代实验技术的不断进步,24 h尿SPEP/IFE的应用也变得不再重要。所有新诊断的MM都需要经历骨髓活检,骨髓细胞形态学观察、免疫组化、FCM检测免疫表型等成为临床诊断MM的重要手段。

骨髓细胞形态学检查是MM的重要诊断方法,获取骨髓液容易,细胞形态清楚,操作简单,在临床应用广泛,通过骨髓穿刺、涂片,对骨髓细胞形态学情况进行观察,可有效判断MM,观察患者的骨髓细胞形态学改变情况,可有效诊断MM[7]。但因肿瘤性浆细胞形态多样,MM细胞大小既可以是大于正常浆细胞,也可以小于正常浆细胞或正常大小,骨髓瘤细胞与正常浆细胞的相似度较高,尤其是对于反应性浆细胞增多症、巨球蛋白血症进行鉴别诊断时,患者的骨髓形态表现为MM相似,通过形态学特征无法做出准确的诊断[8]。另外,由于骨髓涂片以形态学为基础,缺乏免疫表型支持,具有较强的主观性。在浆细胞数量较少,异型性较小的情况下,骨髓涂片的诊断价值较低,难以与正常骨髓和反应性浆细胞增生区别开来。因此,临床仅依靠骨髓细胞形态学对MM进行诊断较为困难,可考虑将其作为辅助手段。

免疫组化根据原抗体特异性结合的原理,可有效提高诊断准确性,辨别良恶性及疾病的严重程度[9]。FCM是诊断MM的重要手段,可准确、快捷、敏感的定量检测单核细胞膜上或胞内表达的多种抗原,具有很高的客观性,全面评估骨髓瘤的髓外浸润、复发等多个方面,为MM的诊断提供重要参考依据[10]。FCM免疫表型检测主要依赖于表面蛋白的差异表达,能够帮助临床医生准确区分正常浆细胞与恶性浆细胞。有研究[11]表明,正常情况下的浆细胞,会表达CD138、CD45以及CD19,而MM患者的浆细胞会表达CD56、CD38、CD117与CD138,但是不会表达CD27。在骨髓标本制备欠佳,浆细胞在骨髓内表现为间质性及灶性浸润时,准确识别及定量浆细胞的难度较大,会增加临床对MM的难度。在这种情况下,骨髓活检可同时联合免疫组化等方式,进一步提高疾病诊断率,降低漏诊率。

本研究结果显示,78例MM患者,经形态学检查显示,存在不同程度的免疫球蛋白增加及正色素性贫血,浆细胞异常增生;经免疫组化检查显示,CD138阳性表达率为100.00%,Kappa、Lambda阳性表达率分别为71.78%、25.64%。经FCM检查显示,CD38、CD138阳性表达均为100.00%,CD45表达异常,免疫组化、FCM诊断MM阳性符合率比较,差异无统计学意义。说明形态学、免疫组化及FCM在MM的诊断中均有较高诊断符合率。分析原因:形态学检测具有操作简单、快速的优点,固定骨髓细胞后,形态一般清晰,利于辨认,更利于对骨髓细胞进行化学染色及免疫组化进一步检查,不仅可判断骨髓细胞形态是否正常,明确骨髓增生情况,有效诊断MM[11]。但MM浆细胞呈单克隆表达模式,κ和λ为多克隆模式,多以少量至中等量κ为主,仅依靠形态学诊断MM较为困难[12]。而免疫组化存在一定主观性,对于浆细胞数量少,其诊断价值低下,对于正常骨髓及反应性浆细胞增生难以区分。FCM对所有组织细胞均可进行分析,并同时并列分析单个细胞的多方面特征,并定量分析细胞,但也会受到操作的影响,降低对MM的诊断效果[13]。

此外,本研究结果还显示,形态学检查骨髓瘤细胞占比高于免疫组化、FCM检查,说明在检测骨髓瘤细胞占比中形态学检查更具优势。分析其原因可能在于:细胞形态学所得标本为涂片,温室状态下烘干较快,骨髓液中的细胞相对稳定,标本存放时间及运输过程对标本本身影响较小;受各种因素影响免疫组化会造成细胞分布不均匀,引起不同计数区域的骨髓瘤细胞所占比例有较大的差异性[14]。而FCM所需骨髓液抽出后放置在试管中,在运输过程可能会因碰撞导致浆细胞或其他细胞破裂,或因抽取骨髓液未轻轻摇试管促使血液凝固,加上标本送检不及时导致长时间的标本存放,导致血液细胞成分发生变化或细胞表型发生改变,导致FCM测得的骨髓瘤细胞占比较低[15]。

综上所述,形态学、免疫组化及FCM在MM的诊断中均有较高诊断符合率,应根据患者的具体情况,结合三者的特点或联合使用,以提高临床诊断价值。