针灸疗法辅助治疗对缺氧缺血性脑病患儿康复的影响

周艳 赵帅 白越

（1. 新乡市妇幼保健院儿童康复科，河南 新乡 453000； 2. 新乡医学院第一附属医院神经内科，河南 新乡 453000；3. 郑州市儿童医院康复中心七病区，河南 郑州 450000）

新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是围产期内多种因素引起大脑供血、供氧不足导致的脑损伤，是围生期常见的疾病之一，若未及时有效的治疗干预，轻者会导致患儿出现学习障碍、轻瘫、运动落后以及注意力缺陷等问题，重者可造成癫痫、脑性瘫痪、智力障碍等永久性神经系统发育障碍，严重时可危及患儿生命[1,2]。

针灸是中华民族的瑰宝，结合中医理论知识和对穴位的认知，将针灸针采用一定的手法刺入穴位，再辅以捻转与提插等针刺手法进行刺激，以促使气血调和，经络畅通，以治疗相关疾病[3,4]。针灸具有安全有效和不良反应少等优点，在脑梗死等心脑血管疾病中具有较好的治疗效果[5,6]。针灸对新生儿HIE 治疗过程中效果如何，目前你研究报道较少。本研究收集我院收治的46 例HIE 患儿，探讨针灸疗法辅助治疗HIE 患儿的疗效，又通过制备HIE 动物模型，探讨针灸疗法作用的分子机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾性纳入我院2018 年6 月至2020 年6 月新生儿科收治的重度或中度HIE 患儿，根据采用治疗方案不同，分为常规治疗组和联合治疗组，每组23 例。常规治疗组患儿男18 例，女15 例；平均胎龄38.96±0.54 周；窒息程度：中度 19 例，重度4 例。联合治疗组患儿男16 例，女17 例；平均胎龄39.04±0.47 周；窒息程度：中度17 例，重度6 例。两组患儿基本临床资料均衡可比(P＞0.05)。本研究通过我院伦理委员会审批。

纳入标准：符合HIE 的临床诊断标准[7]，且经头颅CR 或MRI 确诊；患儿均为重度或中度HIE；排除标准：存在先天性和遗传性疾病；早产儿、畸形儿和肺炎患儿。

1.2 实验材料

7 d 新生小鼠来源于上海斯莱克实验动物有限公司(许可证号：SCXK 京-2013-005)。半胱天冬酶-3（Caspase-3）、B 细胞淋巴瘤因子2（B cell leukemia iymphoma-2，Bcl-2）和Tubulin 小鼠的单克隆抗体来源于美国的Santa Cruz 公司；HRP标记羊抗小鼠的二抗来源于杭州华安公司；TUNEL 染色试剂盒来源于南京诺唯赞生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 方法

1.3.1 临床治疗方法

两组患者均接受HIE 综合治疗，包括控制颅内压、治疗惊厥、高压氧、维持正常通气、维持良好的组织灌注、控制血糖浓度等。

常规治疗组：给予脑活素2 mL，加入10%葡萄糖50 mL 静脉点滴，Qd；丹参注射液1 mL，10%葡萄糖50 mL 静脉点滴，Qd。

联合治疗组：在常规治疗组基础上采用针灸辅助治疗。针灸治疗方案如下：按照患儿的神经损伤程度和损伤部位不同，针灸不同的穴位。智力发育迟缓的患儿主要针灸百会穴和四神聪穴；颈无力患儿主要针灸颈夹脊穴、大椎穴和天柱穴；腰部萎软患儿针灸肾俞穴、腰夹脊穴和腰阳关穴；上肢瘫痪患儿主要针灸肩髎穴、肩髃穴、曲池穴、手三里穴、合谷穴和外关穴；下肢瘫痪的患儿主要针灸髀关穴、环跳穴、伏兔穴、阳陵泉穴、解溪穴和悬钟穴；前臂内旋和后伸患儿主要针灸肩前穴、肩贞穴和肘尖穴；拇指内收的患儿主要针灸鱼际穴；手腕下垂的患儿主要针灸外关穴、阳溪穴和阳池穴；足内翻的患儿主要针灸昆仑穴和悬钟穴；足外翻翻的患儿主要针灸太溪穴和三阴交穴；手指握拳的患儿主要针灸后溪穴、合谷穴和八邪穴；癫痫患儿主要针灸腰奇穴、鸠尾穴、申脉穴、内关穴和照海穴；视觉障碍患儿主要针灸攒竹穴、球后穴、承泣穴和睛明穴；听觉障碍患儿主要针灸角孙穴、听会穴、听宫穴和翳风穴；语言障碍患儿主要针灸哑门穴、通里穴和廉泉穴。常规消毒，选取直径为0.3 mm，长度为25 mm 毫针，背俞穴宜斜刺、浅刺，进针0.2～0.3 寸；其余部位刺入深度0.5～1 寸，不留针。Qd，10 d 为1个疗程，治疗3 个疗程。

1.3.2 动物模型构建

随机将30 只ICR 小鼠分为针灸组、模型组和假手术组，每组10 只。假手术组仅在颈部正中做手术切口，分离但不闭合颈总动脉，不缺氧处理，起对照作用，未制作成缺氧缺血脑病动物模型。模型组和针刺组小鼠分离并闭合颈总动脉，然后给予缺氧处理，制作成缺氧缺血脑病动物模型。假手术组和模型组不做任何治疗，而针刺组新生小鼠根据《实验针灸学》中的针灸方法，采用无菌的针灸针在小鼠的第七颈椎和第一胸椎的棘突间的背部中央位置进行斜刺，留针20 min，Qd。

1.4 观察指标

1.4.1 临床疗效

疗效评定参考《现代儿科学》中HIE 的临床诊断标准评估疗效。治疗3 个疗程后，患儿的呼吸基本恢复平稳、意识基本恢复清晰、惊厥的次数明显减少判定为显效；治疗3 个疗程后，患儿惊厥和意识有一定改善，有较弱的反射，肌力有所改善判定为有效；治疗3 个疗程后，患儿的临床症状改善程度未达到以上标准，或病情有恶化趋势则判定为无效。显效和有效率之和视为总有效率。

1.4.2 神经营养因子水平

治疗前和治疗3 个疗程后，采集两组患儿的静脉血，3000 r·min-1的速率离心大约10 min 后，分离血清，采酶联免疫吸附法检测患儿的神经营养因子神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）和脑红蛋白水平。

1.4.3 神经行为检测量表（Neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）和格赛尔发展量表（Gesell）评分

治疗前和治疗3 个疗程后，采用NBNA 量表测定患儿原始反射、行为能力、被动肌张力和主动肌张力等指标变化。

总分40 分，分数越高，提示患儿的神经功能发育得越好。采用Gesell 量表测定患儿的发育情况。满分100 分。评分越低，表明患儿的发育缺陷越严重。

1.4.4 新生小鼠脑组织凋亡相关蛋白的表达

采用蛋白免疫印迹法检测新生小鼠脑组织凋亡相关蛋白的表达。三组大鼠麻醉后进行处死，留取脑部组织100 mg，加入组织裂解液，冰上充分裂解后，15 000 r·min-1的速率进行离心约15 min后，取上清，测定总蛋白浓度。

另取25 μg 进行SDS-PAGE，并转到PVDF膜上，采用浓度为5%的脱脂奶粉进行封闭，共2 h，再用一抗按照一定比例稀释4 ℃孵育，然后用HRP 标记的羊抗小鼠二抗在室温下进行孵育，共2 h，采用PBST 进行3 次洗涤后，采用ECL 发光液处理，凝胶成像系统成像。

1.4.5 新生小鼠脑细胞凋亡水平

采用TUNEL 染色检测新生小鼠脑细胞凋亡水平。

三组新生小鼠麻醉处死后，脑组织用石蜡包埋，切成5 μL，在二甲苯中进行5 min 的脱蜡，然后重新更换二甲苯，再次进行5～10 min 的脱蜡。放入无水乙醇中5 min，放入浓度为90%的乙醇中2 min。放入浓度为70%的乙醇中2 min，放入蒸馏水中2 min。加入不含有DNase 的蛋白酶K(20 mg·mL-1)，HBSS 进行3 次洗涤。添加适量的检测液TUNEL，充分混匀后滴到载玻片上，在37°C 温度下避光进行孵育60 min。HBSS 3 次洗涤，抗荧光的淬灭封片液进行封片后，采用荧光显微镜进行观察、读片。

1.5 统计学分析

所有数据均采用SPSS 21.0 进行分析。计数资料用n（%）表示，行χ2检验；计量数据采用（）表示，两组数据比较采用独立样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿疗效比较

常规治疗组患儿临床治疗总有效率（73.91%）明显低于联合治疗组（95.65%）（P＜0.05）。

2.2 两组患儿神经营养因子比较

治疗前，两组患儿神经营养因子NSE 和脑红蛋白水平比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。治疗后，两组患儿神经营养因子NSE 和脑红蛋白水平低于治疗前（P＜0.05），且联合治疗组患儿NSE和脑红蛋白水平低于常规治疗组（P＜0.05）。

表1 两组患儿临床疗效比较（n（%），n=23）

表2 两组患儿神经营养因子比较（，n=23）

表2 两组患儿神经营养因子比较（，n=23）

注：与治疗前比较，#P＜0.05；与常规治疗组比较，*P＜0.05。

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2.3 两组NBNA、Gesell 评分比较

治疗前，两组患儿NBNA 和Gesell 评分比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。治疗后，两组组患儿治疗后NBNA 和Gesell 评分高于治疗前（P＜0.05），且联合治疗组患儿NBNA 和Gesell 评分高于常规治疗组（P＜0.05）。

2.4 新生小鼠脑组织凋亡蛋白表达水平

模型组新生小鼠脑组织Caspase-3 表达水平高于假手术组，而Bcl-2 表达水平低于假手术组（P＜0.05）。针灸组新生小鼠脑组织Caspase-3 表达水平低于模型组，而Bcl-2 表达水平高于模型组（P＜0.05）。

2.5 新生小鼠脑细胞凋亡水平

TUNEL 染色结果显示，模型组新生小鼠脑组织凋亡水平高于假手术组（P＜0.05）。针灸组新生小鼠脑组织细胞凋亡水平低于模型组（P＜0.05）。

表3 两组患儿NBNA、Gesell 评分比较（，n=23）

表3 两组患儿NBNA、Gesell 评分比较（，n=23）

注：与治疗前比较，#P＜0.05；与常规治疗组比较，*P＜0.05。

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表4 三组小鼠Caspase-3 和BCL-2 蛋白表达比较（，n=10）

表4 三组小鼠Caspase-3 和BCL-2 蛋白表达比较（，n=10）

注：与假手术组比较，&P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

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图1 TUNEL 染色分析假手术组、模型组和针灸组小鼠细胞凋亡水平

3 讨论

HIE 发病机制较为复杂，多数研究显示缺氧缺血会导致新生儿脑组织出现水肿，脑细胞无氧代谢能力增加，脑组织酸性代谢物大量产生，造成脑细胞损伤，细胞出现凋亡等现象，最终造成脑细胞的损伤。有效改善脑组织缺氧缺血状态，降低脑组织细胞的凋亡水平，对于缓解和治疗缺氧缺血性脑损伤，提高患儿并发症和残疾具有重要的意义。目前针对HIE 的辅助疗法较多，包括亚低温治疗、高压氧舱、水疗抚摸和音乐疗法等，对HIE 有一定疗效[8-10]。

HIE 在中医理论中属于五软、五迟和五硬范畴。针灸可采用针刺和艾灸方式作用于穴位，可起到阴阳调和、祛邪、扶正、疏经、通络等作用[11]。本研究发现在常规治疗基础上采用针灸治疗后结果显示，临床治疗有效率从73.91%提高至95.65%，表明针灸辅助西医常规治疗可提高HIE疗效。NSE、脑红蛋白可反映机体的神经损伤程度，脑部神经发生损伤时，NSE 和 脑红蛋白水平显著升高[12-13]。本研究显示经针灸辅助治疗后可显著下调神经营养因子NSE 和脑红蛋白水平，说明针灸对神经功能具有保护作用。后续研究也证实针灸可显著改善脑损伤程度，促进中枢神经系统的功能发育，提示针灸对HIE 患儿的神经细胞具有修复作用。

本研究在动物水平上进一步分析了针灸对新生小鼠HIE 脑部神经的影响，结果显示，针灸可降低新生小鼠HIE 脑部Caspase-3 蛋白表达，升高Bcl-2 蛋白表达，说明针灸可抑制新生小鼠HIE脑部细胞凋亡，TUNEL 染色液进一步证实，针灸可抑制新生小鼠HIE 脑部细胞凋亡，提示针灸对HIE 的治疗作用时通过调控脑细胞的凋亡实现的。

综上所述，针灸疗法辅助治疗HIE 患儿具有较好的临床效果，基础研究证实针灸通过激活神经营养因子分泌和抑制神经细胞的凋亡，达到有效治疗HIE 的目的。