山茱萸中1个新的酚酸类化合物

高洪敏，彭中灿，王利杰，潘雪格，赫 军，张维库，续洁琨

山茱萸中1个新的酚酸类化合物

高洪敏1, 2，彭中灿1, 3, 4，王利杰1, 3, 4，潘雪格1, 3, 4，赫 军4，张维库3*，续洁琨2*

1. 北京中医药大学中药学院，北京 100029 2. 北京中医药大学生命科学学院，北京 100029 3. 中日友好医院 临床医学研究所，北京 100029 4. 中日友好医院 药学部，北京 100029

研究山茱萸水提取物部位的化学成分。采用多种色谱技术进行分离纯化，通过质谱及核磁共振等方法对化合物进行结构鉴定，并以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标对其降糖活性进行研究。从山茱萸水提取物中分离得到了1个酚酸类化合物，鉴定为2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羟基苯基4-羟基苯甲酸酯（1）；α-葡萄糖苷酶抑制活性的半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值为7.439 μmol/L。化合物1为新的酚酸类化合物，命名为山茱萸酸酯A，其具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

山茱萸；酚酸类；山茱萸酸酯A；α-葡萄糖苷酶抑制活性；降糖活性

山茱萸又称“山萸肉”，俗名枣皮，为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸Sieb.的干燥成熟果实[1]，味酸涩，性微温，主产于陕西、浙江、河南等省，有补益肝肾、涩精固脱的功效[2]。山茱萸的化学成分主要有酚酸类、萜类、黄酮类等[3-5]。药理学研究表明山茱萸在糖尿病的防治、抗炎、心脑血管的保护、神经保护等方面有较好的活性[3-6]。本课题组前期对山茱萸的化学成分及其生物活性进行了持续和较为系统的研究[3-22]，发现山茱萸水提取物具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，结合山茱萸常被作为传统中医药在降糖方剂中的药材，因此研究其降血糖作用物质基础具有重要意义。

本研究首先对山茱萸的水提取物进行分离纯化，从中分离得到了1个新的酚酸类化合物，鉴定为2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羟基苯基4-羟基苯甲酸酯（1），命名为山茱萸酸酯A（图1）；进而以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标，评价了其降糖活性。

图1 化合物1的化学结构

1 仪器与材料

Bruker AV-400型核磁共振（Bruker Biospin公司）；Nicolet IS5型红外光谱仪（Thermo Fisher公司）；Q-Exactive Orbitrap型液相色谱-质谱联用仪（Thermo Scientific公司）；Agilent 1260 Infinity II型分析液相（DAD检测器）；岛津制备液相（泵：LC-20AR，检测器：SPD-20A）；WFH-203型三用紫外分析仪；Sartorius-BS223S型电子分析天平；柱色谱硅胶（100～200、200～300目）为青岛海洋化工厂生产；硅胶GF254薄层预制板为烟台化学工业研究所产品；ODS（30～50 μm）为YMC公司生产；Sephadex LH-20型凝胶为Pharmacia公司生产；制备型HPLC色谱柱为Phenomenex Gemini C18色谱柱（250 mm×20 mm，5 μm）；分析型HPLC色谱柱为ES Sonoma C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；酶标仪Spark（Tecan公司）；96孔板（Coster公司）；pNPG N1377（源叶生物，批号S10137）；α-葡萄糖苷酶（Sigma公司，批号G9259）；阿卡波糖（源叶生物，批号S11190）；磷酸盐缓冲溶液PBS（Coolaber公司）；其余试剂均为分析纯（北京化工厂）和色谱纯（Honeywell）。

本研究所用山茱萸为2013年11月采自陕西省佛坪县，由北京中医药大学续洁琨教授鉴定为山茱萸属植物山茱萸Sieb. 的干燥成熟果实，样品（20131106）目前存放于中日友好医院临床医学研究所。

2 提取与分离

将63 kg干燥的山茱萸果实用水煎煮提取2次（600、500 L），每次2 h。合并提取液，减压浓缩得到总浸膏约28.9 kg。总浸膏用水混悬后经D101型大孔吸附树脂柱，依次用水、30%、55%、95%乙醇洗脱。55%乙醇洗脱部位浓缩后得浸膏388 g，将其用硅胶1∶1拌样，采用硅胶开放柱（200～300目，Φ7.5 cm×118 cm）用氯仿-甲醇梯度洗脱进行分离得到8个流分CO-C1～CO-C8。

流分CO-C4（101 g）经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇（100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70）梯度洗脱，TLC点板分析合并为6个流分（C4-1～C4-6），其中流分C4-2～C4-4经点板合并后过ODS柱色谱（甲醇-水1∶9→10∶0）并经TLC点板分析合并得到8个流分（C4-B1～C4-B8）。其中C4-B7过Sephadex LH-20凝胶柱色谱（甲醇-水1∶1→1∶0）经TLC分析合并得到10个流分（B7-A～B7-J），B7-G经Pre-HPLC分离得到化合物1（38.6 mg）[色谱柱Phenomenex Gemini C18（250 mm×20 mm，5 μm）；体积流量3 mL/min；流动相55%甲醇；R＝26 min]。

3 结构鉴定

化合物1：褐色粉末。HR-ESI-MS/331.082 3（[M－H]−，计算值为331.081 2），可确定化合物的分子式为C17H16O7，计算其不饱和度为10。红外光谱显示其结构中含有羟基（3415 cm−1）和羰基（1713 cm−1）和苯环（1516 cm−1）等基团。紫外光谱显示在206 nm和264 nm处有特征吸收。

1H-NMR (400 MHz, Methanol-4) 谱（表1）显示1个甲基质子信号H1.10 (3H, t,= 7.2 Hz, H-10)；1组亚甲基质子信号H4.00 (2H, q,= 7.2 Hz, H-9), 3.49 (2H, s, H-7)；1组对取代苯上质子信号H8.00 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3′, 5′)，提示该化合物存在1个对位取代的苯环结构；1对间位偶合的苯环质子信号H6.27 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3), 6.17 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5)，提示还存在1个四取代的苯环结构。

13C-NMR (100 MHz, Methanol-4）谱（表1）显示共17个碳信号，结合HSQC谱确定该化合物含有1个甲基碳信号C14.5 (C-10)；2个亚甲基碳信号C61.9 (C-9), 30.3 (C-7)；2组苯环上碳信号C164.4 (C-4′), 158.7 (C-4), 158.5 (C-6), 152.5 (C-2), 133.6 (C-2′, 6′), 121.5 (C-1′), 111.6 (C-3′, 5′), 107.3 (C-1), 102.3 (C-3), 101.1 (C-5)；2个羰基碳信号C174.0 (C-8), 166.2 (C-7′)。化合物1的波谱数据与已知化合物2--(4-hydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxy- phenylacetate[23]的波谱数据非常相似，不同之处在于化合物1多了1个乙氧基信号[H4.00 (2H, q,= 7.2 Hz), 1.10 (3H, t,= 7.2 Hz)；C61.9, 14.5]，少了1个甲氧基信号[H3.54 (3H, s, OCH3),C52.4]。

表1 化合物1的1H-和13C-NMR数据(400/100 MHz, Methanol-d4)

Table 1 1H- and 13C-NMR data for compound 1 (400/100 MHz, Methanol-d4)

碳位δHδc 1 107.3 2 152.5 36.17 (d, J= 2.4 Hz)102.3 4 158.7 56.27 (d, J= 2.4 Hz)101.1 6 158.5 73.49 (s)30.3 8 174.0 94.00 (q, J= 7.2 Hz)61.9 101.10 (d, J= 7.2 Hz)14.5 1′ 121.5 2′8.00 (d, J= 8.8 Hz)133.6 3′6.90 (d, J= 8.8 Hz)116.6 4′ 164.4 5′6.90 (d, J= 8.8 Hz)116.6 6′8.00 (d, J= 8.8 Hz)133.6 7′ 166.2

在HMBC谱（图2）中，H-5 (H6.27) 与C-1 (C107.3), C-3 (C102.3), C-4 (C158.7) 相关，H-3 (H6.17) 与C-1 (C107.3) 相关；同时，H-2′ (H8.00) 与C-7′ (C166.2), C-4′ (C164.4) 相关，H-5′ (H6.90) 与C-1′ (C121.5), C-4′ (C164.4) 相关，结合碳谱、氢谱进一步确定了其结构中存在1个间苯三酚和1个对羟基苯甲酰的结构。另外，H-7 (H3.49) 与C-1 (C107.3), C-2 (C152.5) 和C-8 (C174.0) 相关，H-9 (H4.00) 与C-8 (C174.0), C-10 (C14.5) 相关，H-10 (H1.10) 与C-9 (C61.9) 相关，说明乙氧基与C-8位的羰基相连。综上所述，该化合物为2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羟基苯基-4-羟基苯甲酸酯，经SciFinder文献数据库检索发现该化合物为未见报道的新化合物，命名为山茱萸酸酯A。

图2 化合物1的主要HMBC

4 降糖活性测定

以4-硝基酚-β--吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl- β--glucopyranoside，PNPG）为底物测定α-葡萄糖苷酶的活性，以阿卡波糖作为阳性对照，在96孔板上进行活性检测。100 μL PBS缓冲溶液（pH 7.4）中加入20 μL α-葡萄糖苷酶（0.125 U/mL）溶液，以及20 μL不同浓度的化合物1（0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L），37 ℃恒温15 min，然后加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L），37 ℃恒温15 min，再加入40 μL的Na2CO3溶液（0.2 mol/L）终止反应，在405 nm波长下测定吸光度（）值[24-26]。按照公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率。

抑制率＝[(对照－空白对照)－(样品－样品对照)]/(对照－空白对照)

空白对照为加入缓冲液代替样品的空白对照0 min时的值，对照为对照15 min时的值，样品对照为加入测试样品0 min时的值，样品为加入测试样品15 min时的值

结果表明，化合物1在20 μmol/L表现出较好的抑制活性，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值为7.439 μmol/L，其效果优于阳性药阿卡波糖（IC50＝642.4 μmol/L）。

5 结语

本研究从山茱萸水提取物中分离鉴定了1个新的酚酸类化合物山茱萸酸酯A，进一步发现其对α-葡萄糖苷酶活性（IC50＝7.439 μmol/L）明显优于阳性药阿卡波糖（IC50＝642.4 μmol/L）。本研究一方面丰富了山茱萸的化学成分多样性，另一方面为阐明山茱萸的降糖药效物质奠定了基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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A new phenolic acid from

GAO Hong-min1, 2, PENG Zhong-can1, 3, 4, WANG Li-jie1, 3, 4, PAN Xue-ge1, 3, 4, HE Jun4, ZHANG Wei-ku3, XU Jie-kun2

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China 4. Department of Pharmacy, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

To study on the constituents from water extract of.The water extract ofwas separated and purified by use of various chromatographic techniques, and the structures of the isolates were elucidated by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The hypoglycemic activity of the compounds using α-glucosidase inhibitory activity as index was also investigated.One phenolic acid compound was isolated from the extract ofand identified as 2-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-3,5-dihydroxyphenyl 4-hydroxybenzoate (1). The IC50value of the α-glucosidase inhibitory activity was 7.439 μmol/L.Compound 1 is a new phenolic acid, named cornusester A, with good α-glucosidase inhibitory activity.

Sieb.; phenolic acids; cornusester A; α-glucosidase inhibitory activity; hypoglycemic activity

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5142 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.002

2023-05-30

中央高水平医院临床科研业务费（2023-NHLHCRF-CXYW-01，2022-NHLHCRF-YNZJ-01）；国家自然科学基金项目（82073731，82273815，82273809）；中国药学会以岭生物医药创新基金（CPA-B04-ZC-2021-005）；中国医学科学研究院基本科研业务费（2022- JKCS-1616）；天然药物活性物质与功能国家重点实验室开放基金（GTZK202101，GTZK202206）；中日友好医院菁英计划（ZRJY2021-BJ06，ZRJY2021-TD06）

高洪敏（1982—），女，在职硕士，从事中药物质基础研究。

张维库，男，博士，研究员，从事中药活性成分的发现和新药开发。Tel: (010)84205766 E-mail: cpuzwk@163.com

续洁琨，女，博士，教授，研究方向为中药药理和新药开发。Tel: (010)84205360 E-mail: xjkbucm@163.com

[责任编辑 王文倩]