博落回牛至油凝胶剂对肉鸡生长性能及肠道微生物菌群的影响

孙媛媛，张海龙，梁春彩，魏玉杰，刘聚祥

（河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071000）

牛至油是从牛至属植物牛至中提取的具有特殊芳香气味的一种挥发油，其主要成分为萜类化合物［1-2］。博落回提取物是从博落回属植物博落回中提取的生物碱，其主要成分为血根碱［3］。大量研究表明，牛至油和博落回具有抗炎、抑菌、抗氧化和免疫调节的作用［4］，在饲粮中添加适量的牛至油和博落回可促进家禽营养物质的吸收，提高其生长性能，有效调节肠道微生物区系平衡，改善肠道形态和促进黏膜发育，增强机体抗氧化能力，提高免疫力和疾病防治［5-7］。最早出现的牛至油市售产品是荷兰罗帕法姆公司生产的诺必达(RopadiarTM)牛至油预混剂，是在1995 年研发出的产品，诺必达是纯天然牛至提取物，其牛至油含量≥5%，由于是进口产品，其价格相对较高，应用成本也较高。博落回提取物（Sangrovit®）最早由德国的Phytobiotics 公司生产。国内的主要产品为湖南美可达生物资源股份有限公司研发的美佑壮博落回散，为二类中兽药制剂。这些产品均为预混剂，需要混饲使用，不太方便。而本试验的博落回牛至油凝胶剂可以直接撒在地面上，供肉鸡自由采食用于水分补充和营养供给，使用便捷。但目前尚未有对其系统的研究。因此，本试验旨在研究博落回牛至油凝胶剂对肉鸡生长性能和肠道菌群的影响，为其在肉鸡中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 本试验所用博落回牛至油凝胶剂由河北农业大学动物医学院提供，牛至油(批号：20200812，含量≥90%)购自江西海瑞天然植物有限公司；博落回提取物（批号：F01040020091801，含量≥60%）购自湖南汉清生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验动物选择1 日龄白羽肉仔鸡60 只，分为4 组，每组3 个重复，每个重复5 只。4 组分别为博落回凝胶剂组（MCE）、牛至油凝胶剂组（OEO）、博落回牛至油凝胶剂组（MCOEO）、空白对照组（CK）。给药量按照肉鸡饲料采食量（MCE：2.5 mg/kg, OEO：12.5 mg/kg）进行添加。

1.2.2 生长性能 试验当天早晨称重计算初始平均体重，试验期间每天记录饲料的添加量和剩余料重，在试验的第8 天、第15 天和第22 天早晨称量体重，计算日采食量（ADFI）、日增重（ADG）和料重比（F/G）。

1.2.3 肠道菌群检测 在试验的第1 天、第8 天、第15 天和第22 天早晨随机采取新鲜粪便，每组取4 管（1 g 左右），装入无菌冻存管中，编号后装进冰盒中储存，每次采样完成后放入-80 ℃保存。待全部采样完成后一起送广东美格基因科技有限公司进行16SrRNA 基因V3-V4区检测测序。

1.2.4 数据处理与分析 基础数据采用Excel处理，试验利用SPSS19.0 作统计学分析，各组数据以平均值±标准差表示，采取单因素方差分析（one-way ANOVA）和邓肯检验（Duncan）。P＜0.05 表示为差异显著，P＞0.05 表示为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 凝胶剂对肉鸡生长性能的影响

由表1 可知，试验第1 ～7 天，MCOEO 组的日增重显著高于OEO, CK 两组（P＜0.05），给药组均高于CK 组（P＜0.05）；给药组的料重比相较CK 组均有所降低，其中MCOEO 组料重比显著低于MCE 和CK 组（P＜0.05）。试验第8 ～14 天，给药组的日增重相比较CK 组均有所升高，其中MCOEO 组日增重显著高于CK 组（P＜0.05），料重比显著低于OEO、CK 2 组（P＜0.05）。试验第15 ～21 天，给药组的日增重相比较CK 组均有所升高，其中MCOEO 组日增重显著高于OEO、CK 2组（P＜0.05），料重比显著低于其他3 组（P＜0.05）；MCE、OEO 组料重比均低于CK 组对照组（P＜0.05），整个试验期间，单药组之间无显著差异（P＞0.05）。

表1 凝胶剂对肉鸡生长性能的影响Table 1 Effects of gels on growth performance of broiler chickens

2.2 凝胶剂对肉鸡肠道菌群的影响

2.2.1 Alpha 多样性分析 肠道菌群的多样性，其中常见的Alpha 多样性指数包含反映菌群丰富度的Chao1 指数和反映菌群多样性的Shannon 指数和Simpson 指数。7 d 时，各组之间的3 个指数均无明显差异；14 d 时，Chao1 指数之间无明显差异，但给药组均高于对照组，OEO 组的Shannon 指数和Simpson 指数均与MCOEO 组、CK 组有显著差异（P＜0.05），且给药组的Shannon 指数均高于对照组，Simpson 指数均低于对照组，说明给药组在菌群多样性方面较优于对照组；21 d 时，OEO 组的Chao1指数与其他组均有显著差异（P＜0.05），Shannon指数和Simpson 指数与MCOEO、CK 两相比均有显著差异（P＜0.05）。以上结果表明，随着给药时间的增加，给药组的Shannon 指数和Chao1 指数从7 d 低于对照，到14、21 d 时高于对照，说明该药物在一定程度上提高了菌群的多样性和丰富度（见表2）。

表2 不同组Alpha 多样性指数Table 2 Alpha diversity index of different groups

2.2.2 Beta 多样性分析 为了探讨不同时期各给药组肉鸡菌群群落之间的相似度，本试验通过主坐标分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）来分析菌群群落间的关系，基于Bray-Curtis 算法对样品进行分析，如图1 所示。

图1 同一时期不同组PCoA 图Fig.1 PCoA diagrams of different groups during the same period

试验发现，7 d 时，可见4 组在一定的水平上不同样品间存在着聚集，说明给药组和对照组的细菌群落结构始终有着一定的相似性；14 d 时，4 组在一定的程度上不同样品之间存在着聚集，MCOEO组和CK 组有着最接近的距离，说明给药组和对照组的细菌群落结构在14 d 有着较高的相似性，MCOEO 组和对照组在14 d 微生物群落差异极小；21 d 时，4 组在一定的程度上不同样品之间存在着聚集，但OEO 组和CK 组距离较远，表明OEO 组和CK 组之间微生物群落组成相似度较低。在不同时期，给药组和对照组无明显差异，聚类簇均有所聚集，群落差异较小，始终有着一定的相似性。

2.2.3 门水平物种组成分析 本试验根据门水平的菌群分类结果，选择物种组成中相对丰度大于1%的菌群，形成物种组成柱状图。图2 为不同时期各个试验组属水平的物种组成柱状图。从图中可以看出，整个试验周期，MCOEO 组厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度增加率高于对照组，变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度下降率高于对照组。单方药物组拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度增加率较高。

图2 同一时期不同组门水平物种组成柱状图Fig.2 Horizontal histogram of species composition phylum level of different groups during the same period

2.2.4 属水平物种组成分析 为了进一步探讨白羽肉鸡肠道微生物多样性，本试验更深入的研究了其在属水平上的组成和变化情况。本试验依据属水平的菌群分类结果，选择菌群组成中相对丰度Top10 的菌属，形成物种组成柱状图。图3 为不同时期各个试验组属水平的物种组成柱状图，从图中发现，整个试验周期，乳酸杆菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）、埃希氏- 志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）的相对丰度变化趋势和其对应门水平变化趋势相似，即MCOEO 组Lactobacillus相对丰度增加率高于对照组，Escherichia-Shigella的相对丰度下降率高于对照组。单方药物组Bacteroides相对丰度增加率较高。

图3 同一时期不同组属水平物种组成柱状图Fig.3 Horizontal histogram of species composition of different groups during the same period

2.2.5 LEfSe 分析 LEfSe 分析通过Wilcox 秩和检验（Wilcoxon rank-sum test）分析比较肠道内容物中的差异菌群，在组间各分类水平中按照设置的筛选指标，即LDA score=4，找到满足需求的显著差异菌种（Biomarker），LDA 值分布柱状图中的各长度代表Biomarker 的影响大小。各组同一时期物种LDA 值分布柱状图如图4 所示。

图4 同一时期不同组物种LDA 值分布柱状图Fig.4 Histogram of LDA value distribution of different groups during the same period

7 d 时，4 组之间无差异显著菌种；14 d 时，MCE 组中富集的Biomarker 有唾液乳酸杆菌（Lactobacillus_salivarius），CK 组包括纤线杆菌科下1 种未命名菌属，MCOEO 组包括乳酸杆菌属下1种未命名菌种；21 d 时，MCE 组中包括瘤胃球菌UCG-014 属（Ruminococcaceae_UCG-014）和 该 菌属下1 种未命名菌种，OEO 组中富集的Biomarker有：瘤 胃 球 菌 科（Ruminococcaceae）、消 化 链球菌科（Peptostreptococcaceae）、罗姆布茨菌属(romboutsia)及该菌属下1 种未命名菌种、巴恩斯氏菌科（Barne-siellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae），MCOEO 组中包括乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）。

3 结论与讨论

3.1 凝胶剂对肉鸡生长性能的影响

家禽的生长性能主要体现在平均日采食量、日增重和料重比［8］。Zhang 等研究表明，在试验期的前21 天，饲粮中添加牛至油的平均日增重均高于对照组（P＜0.05），料重比均优于对照组（P＜0.05）平均日采食量无明显差异［9］。Mohiti 等研究发现，在饲粮中添加600 mg/kg 的牛至提取物可以明显改善肉鸡的料重比和生长性能［10］。El-Sheikh 等研究结果表明，在基础饲粮中添加博落回提取物的科宝肉鸡平均日增重和平均日采食量均显著提高，饲料利用率得到改善［11］。本试验结果也表明给药组与对照组相比均可一定程度提高肉鸡的日增重，改善料重比。Amer 等研究表明在饲粮中添加单月桂酸甘油酯和牛至油可以增加肉鸡的日增重，进而改善料重比，获得较优的生长性能［12］。本试验中，博落回牛至油凝胶剂的效果优于对照组，且优于单方药物组，推测博落回牛至油凝胶剂对肉鸡生长性能起相加或促进作用。同时从试验结果可以看出，试验期的8 ～14 d 为肉鸡的迅速生长期，在此期间，肉鸡的日增重较高，饲料转化率也较高，表明该药物在肉鸡早期应用效果较好。

3.2 凝胶剂对肉鸡肠道菌群的影响

肠道菌群是机体应对外界环境变化和对抗疾病的主要方法之一，是平衡胃肠道内环境稳态的关键要素［13］。研究发现，大多植物提取物很大程度上通过调控肠道菌群来发挥其作用效果［14-15］。饲粮中添加博落回提取物和牛至油均可调节菌群平衡［16-17］。Chao1 指数越大，菌群数越多。Shannon 指数数值越高，Simpson 指数数值越低，多样性越高［18］。本试验中，给药组的Chao1 指数和Shannon 指数在试验后期均高于对照组，说明这2 种药物提高了肉鸡肠道菌群的物种丰富度和多样性。同时给药组和对照组Beta 多样性图中各聚类簇均有所聚集，表明4 组的肠道菌群结构始终有着一定的相似性，博落回、牛至油对肉鸡肠道微生物群落结构组成无明显影响。

门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度较高且厚壁菌门占有绝对的地位优势［19］。本试验中，给药组的厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度增加率高于对照组。厚壁菌门可以产生抗性内生孢子并在肠道内生长，来保持环境内的活力并促进传播。拟杆菌门的细菌可以与机体内其他共生细菌发生相互作用，有助于消化食物中的纤维素，它们的相对丰度变化对机体的脂肪代谢能力有影响［20］。在试验中，乳酸杆菌属、拟杆菌属和埃希氏志贺氏菌属相对丰度大于70%，MCOEO 组乳酸杆菌属相对丰度增长率和埃希氏志贺氏菌属相对丰度下降率高于对照组；单方药物组拟杆菌属相对丰度增加率较高。乳酸杆菌属能够在肠上皮细胞形成一道菌膜屏障，可以一定程度抵御肠杆菌及一些外源性致病菌的定植。拟杆菌属可以降解多糖，提高动物的营养吸收率，维持肠道菌群平衡，提高机体的免疫力［21］。

LEfSe 分析中，同一时期不同组之间，14 d 时期和21 d 时期MCOEO 组中显著差异菌种（Biomarker）均为为乳酸杆菌属；OEO 组显著差异菌种较多，主要有瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、毛螺菌科（Lachnospiraceae）。毛螺菌科可能是一种潜在的有益菌，其产物乙酸有时候是能量的主要来源，其和瘤胃菌科被认为可以发酵纤维素进而抑制炎症性肠炎［22］。罗姆布茨菌属是有益菌属，在促进丁酸生成方面起关键作用［23］。由此可见，博落回、牛至油可以提高肠道有益菌含量。

综上所述，本研究结果表明，博落回凝胶剂和牛至油凝胶剂均可以显著提高肉鸡的生长性能，调节肉鸡肠道菌群的平衡，增加菌群多样性，提高有益菌降低有害菌含量。博落回牛至油凝胶剂还能显著提高乳酸杆菌属的相对丰度，并且促生长效果优于单药组。