基于网络药理学-分子对接技术探讨清瘟败毒饮对川崎病、过敏性紫癜及系统性红斑狼疮的异病同治作用机制

吴邹平，李鲜慧，黄秋琪，吉训超

1. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405

2. 广州中医药大学第八临床医学院，广东 佛山 528051

3. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

川崎病（KD）又称为皮肤黏膜淋巴结综合征（MCLS），主要发生于5 岁以下儿童及婴幼儿，在我国发病率有不断上升的趋势[1-2]，以全身中、小动脉血管炎性病变为特征，可累及冠状动脉引起严重并发症。过敏性紫癜（HSP）临床以出血性皮疹为主要表现，可伴有关节炎、腹痛、血尿及蛋白尿等，是儿童时期最常发生血管炎性疾病[3]。系统性红斑狼疮（SLE）是以免疫炎症及多系统受累为主要特征的结缔组织病，儿童SLE 较成人SLE 病情重，病程长，预后相对更差[4]。这3 种疾病均属于儿童结缔组织病范畴，发病机制尚不清楚，现代医学目前仍缺乏理想的治疗药物。

“异病同治”为中医治疗疾病的重要法则之一，具有重要的临床实践指导意义。虽然KD、HSP、SLE 分别属于3 种不同疾病，但其中医病因病机方面却有着相似之处。清瘟败毒饮出自《疫疹一得》，由清代医家余霖所创，方由白虎汤、犀角地黄汤和黄连解毒汤三方加减而成。现代药理学研究表明，清瘟败毒饮具有解热、降低血液黏稠度、抗血小板聚集、抗菌、抗病毒、抗炎、镇静、镇痛等多种药理作用[5]。临床上有研究表明清瘟败毒饮在治疗KD、HSP、SLE 同样具有较好的疗效[6-10]。中医药在疾病治疗上有多成分、多靶点、多通路协同的特点，在许多疾病治疗，尤其在“异病同治”方面中存在明显的优势。本研究通过网络药理学及分子对接技术，探讨清瘟败毒饮在治疗KD、HSP、SLE 的共同作用机制，为后续临床运用及实验研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 清瘟败毒饮药物有效成分及靶点获取运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），搜索黄连、栀子、桔梗、黄芩、知母、赤芍、玄参、连翘、甘草、牡丹皮有效成分和药物靶点，设置生物利用度≥30%、类药性≥0.18 为筛选条件[11]。对TCMSP 平台上查询不到的石膏、生地黄、水牛角、竹叶等药物，通过检索中医药百科全书数据库（ETCM）及查阅相关文献等方式获得药物成分相关化学信息，并将结果导入PubChem[12]。将获得的结构信息输入SwissADEM 平台，将胃肠道吸收设置为“High”，类药性5 项中（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）满足2 项及以上[13]的化合物纳入研究。另外，通过对已发表的相关中药有效成分文献检索，对中药活性成分做进一步补充。将获取的重要活性成分输入TCMSP 数据库检索对应靶点信息，并通过UniProt 数据库[14]对靶点蛋白基因名称进行规范。

1.2 疾病靶点、药物-疾病交集靶点筛选与获取在 Gencards、 OMIM 数据库分别以“Kawasaki Disease、 Mucocutaneous Lymph Node Syndrome”“Henoch-SchönleinPurpura、Henoch-Schonleinpurpura、IgA vasculitis、Anaphylactoid Purpura”“systemic lupus erythematosus”为关键词检索获取有关KD、HSP、SLE 相关疾病靶点。通过Venn 2.1 在线分析软件对获取的清瘟败毒饮药物有效成分作用靶点与3 种疾病相关作用靶点取交集。

1.3 PPI 网络构建及核心靶点筛选蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析对于了解疾病等特殊生理病理状态下生物信号、能量物质代谢的反应机制及了解蛋白之间的功能联系具有重要意义。将1.2 获取的药物-疾病交集靶点导入String 数据库进行PPI 网络分析，物种选项为“Homo sapiens”，选择高置信度（0.700），绘制PPI 网络关系图，并将分析结果导入Cytoscape v3.9.1[15]软件中，利用Cytoscape 软件中CytoHubba 插件筛选出核心作用靶点。

1.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析将药物-疾病交集靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库中进行基因本体功能富集（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以P＜0.05 表明差异具有统计学意义，通过R4.2.1 中clusterProfiler 包对数据进行整理，并运用ggplot2 包对结果可视化。

1.5 成分-靶点-通路-药物网络图构建将清瘟败毒饮药物活性成分、药物-疾病交集靶点蛋白以及KEGG 富集通路运用Cytoscape v3.9.1 软件构建“药物-有效成分-靶点-通路”关系网络图。通过Network Analyzer 网络拓扑分析，根据拓扑学参数判断清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 主要有效成分，以备后续进一步分析。

1.6 分子对接为了评估药物有效成分与目标靶点的亲和力，选取PPI 网络中筛选得到的核心靶点蛋白为受体，通过PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）获得受体蛋白3D 结构；将药物有效成分作为配体，运用蛋白-配体对接软件AutoDock v1.5.7[16]进行分子对接。根据对接后配体-受体最低结合能绘制热图，当结合能＜-5.0 kcal/mol 时，提示二者之间能够较好地结合；当结合能＜-7.0 kcal/mol 时，则配体和受体具有强烈的结合性[17]。将对接结果导入PyMol v3.7.9 软件进行三维成像可视化。

2 结果

2.1 清瘟败毒饮药物有效成分及靶点综合相关数据库和文献筛选数据，共收集清瘟败毒饮药物有效成分共195 种，其中赤芍13 种，甘草88 种，黄连11 种，黄芩31 种，桔梗4 种，连翘17 种，牡丹皮6 种，生地黄17 种，生石膏2 种，水牛角3 种，玄参5 种，知母11 种，栀子10 种，竹叶9 种，其中有32 种为药物之间共同有效成分。运用TCMSP 数据库对有效成分靶点预测，并通过UniProt 数据库对靶点蛋白基因名称进行规范，删除重复项后，共得到167 个预测靶点。

2.2 疾病靶点、药物-疾病交集靶点筛选与获取见图1。通过对KD、HSP、SLE 相关疾病靶点进行检索去重后，共得到KD 疾病靶点3 536 个，HSP 疾病靶点1 402 个，SLE 疾病靶点5 128 个，运用Venn 2.1 在线分析软件对药物和疾病交集靶点映射，最终获得清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 的潜在靶点38 个，占比0.5%。

图1 清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 交集靶点Venn 图

2.3 PPI 网络构建及核心靶点筛选见图2。将清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 的38 个交集基因导入String 数据库，构建PPI 网络图，该网络包含38 节点，686 条边，如图2A。利用Cytoscape v3.9.1 软件中CytoHubba 插件筛选出核心蛋白，设置Calculate值为Top10，运用Degree 算法得出前10 位相关度最高的潜在核心蛋白靶点，见图2B，推测白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮细胞生长因子A（VEGFA）等为清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 的潜在核心作用靶点。

图2 靶点PPI 网络图

2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析结果见图3。将筛选出的38 个交集靶点通过R4.2.1进行GO 和KEGG 富集分析，根据P值大小倒序排列。通过GO 分析得到生物过程（BP）1 512 条，细胞组分（CC）52 条，分子功能（MF）113 条，见图3A，其中包括了多脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、转录调节复合物（transcription regulator complex）、转录辅调控因子结合（transcription coregulator binding）等。通过KEGG 富集分析共到相关信号通路123 条，具体结果参数见表1。对P值前20 的通路，使用R语言ggplot2 包对结果可视化（图3B），这些潜在的信号通路在清瘟败毒饮异病同治的过程中具有显著作用。

图3 GO 分析柱状图及KEGG 富集分析

2.5 药物-成分-靶点-通路网络图构建见图4。运用Cytoscape v3.9.1 软件构建“药物-成分-靶点-通路”关系网络图，此网络由499 个节点和2 365 条边构成。通过Network Analyzer 网络拓扑分析得到Degree 值排名前6 位的核心药物有效成分主要为槲皮素（Quercetin）、 芹黄素（Apigenin）、 山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、汉黄芩素（Wogonin）。网络图显示脂质与动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）为清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 过程中最重要的通路，因此，可认为清瘟败毒饮最有可能由此通路对这3 种疾病产生潜在的治疗作用。

图4 清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 药物-成分-靶点-通路网络图

2.6 分子对接见图5。为探究清瘟败毒饮干预KD、HSP、SLE 关键分子学机制，将“药物-成分-靶点-通路”网络中Degree 值最高的前6 的有效成分作为配体，PPI 网络中的10 个核心靶点蛋白作为靶点蛋白受体。运用蛋白-配体对接软件AutoDock v1.5.7 获得配体与受体之间相互作用的结合能，结合能越小，则结合越稳定，绘制结合能热图，见图5A，其中横坐标代表靶点蛋白，纵坐标代表清瘟败毒饮有效成分。结果显示，筛选的6 个有效成分与10 个核心靶点之间最低结合能小于-5.0 kcal/mol 的占85%，结合活性较好，其中β-谷甾醇与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）的结合活性最强。选取对接分数最小的前3 组组合结果导入PyMol v3.7.9 软件进行三维成像可视化，见图5B。图中绿色为有效成分，淡蓝色为蛋白，紫色为氨基酸残基部分，黄色虚线为氢键，并标注距离。

图5 分子对接图

3 讨论

“异病同治”作为中医治疗的特色之一，其核心思想强调了“证同治同”，表明中医学中的“证”是一种多系统、多靶点、多层次的病理生理改变[18]。KD 属于中医学温病范畴，中医学认为本病是由于感受温热毒邪，初犯肺卫，后热毒邪气入里，侵犯营血，充斥内外，热毒迫血妄行，可导致发斑、冠状动脉病变等临床症状。HSP 属于中医学血证的范畴，外感风热邪毒而发病，热毒入血，迫血妄行，离经之血致皮肤出现紫癜。SLE 中医称之为“阴阳毒”，在SLE 疾病活动期，多由于邪热壅盛，热灼营阴导致。这3 种疾病虽病症不同，然病机无异，均属于热毒深重，气血两燔之病症，予清瘟败毒饮清热凉血、解毒化斑，体现中医“异病同治”理论思想。

本研究利用TCMSP、ETCM、Pubchem 数据库分别获得清瘟败毒饮中药有效成分及对应靶点，通过GeneCards、OMIM 数据库获得KD、HSP、SLE 疾病靶点，基于Venn 图共获得38 个交集靶点。利用Cytoscape 软件及PPI 网络拓扑分析提示IL-6、VEGFA、PPARG 等是清瘟败毒饮治疗的主要靶点蛋白。IL-6是一种多效性细胞因子，由多种细胞产生，可作用于多种组织，能够参与对免疫应答的调节和炎症反应。在KD 急性期由单核巨噬细胞活化时可产生IL-6[19]，其与疾病过程中血管壁损伤、冠状动脉病变以及静脉注射免疫球蛋白非敏感型KD 的产生密切相关[20]。研究发现，过敏性紫癜性肾炎（HSPN）多由Th2 淋巴细胞分泌的IL-6 刺激引发，各种诱发因素导致患者体内产生过量的IL-6，刺激T 细胞增殖、活化及肾小球系膜增生，使肾小球纤维化且大量IgA、IgE 沉积在肾小球系膜上导致肾炎[21]。一项关于SLE 患者的促炎症细胞因子研究发现高水平IL-6 可促进SLE 患者关节炎进展和关节变形[22]。IL-6 在不同阶段影响KD、HSP、SLE 的发生、发展及愈合，而清瘟败毒饮可有效降低患者IL-6 的水平，控制机体炎症因子的产生。VEGFA 是血管内皮生长因子（VEGF）家族中含量最丰富、最具特征性的成员。VEGFA 对血管形成、内皮细胞生长有显著刺激作用，可促进产生结构不完整的新生血管，增加血管通透性。有研究证实，在KD 的急性期和亚急性期都存在高水平的VEGF 的表达，且患者血管组织发生病理改变，进一步出现血管动态平衡失调和冠脉病变的发生[23-24]。傅卓等[25]通过对HSP、HPSN、健康儿童的VEGF 进行检测，发现VEGF 参与了HSP 血管炎的发生过程，且与肾脏损害程度密切相关。PPAR是一种参与抗炎反应和脂肪生成相关的转录因子[26]，有前瞻性研究表明KD 患者急性期、亚急性期和恢复期的PPARG 基因表达均明显高于健康儿童，认为PPARG 因其抗炎作用可能是KD 的保护因素，并且其表达水平可有效预测KD 冠脉病变的预后[27]。由于动脉粥样硬化导致心血管疾病是SLE 患者最常见的死亡原因之一，目前尚无有效的预防措施[28]。在动物模型中，PPARG 激动剂吡格列酮能够改善血管损伤及内皮功能障碍[29]。进一步的临床试验Hasni S 等[30]也发现吡格列酮能够显著改善SLE 患者的血管僵硬程度和心脏代谢参数，有希望成为SLE 临床治疗药物。清瘟败毒饮主要通过上述3 个主要靶蛋白发挥治疗作用，期待能进一步完善相关基础研究，为KD、HSP、SLE 疾病提供新的治疗思路。

在KEGG 富集分析中，脂质和动脉粥样硬化通路为富集基因最多的关键信号通路。脂质和动脉粥样硬化通路主要功能包括促炎症反应、炎症信号转导、增殖、损伤和凋亡过程，该通路主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白酶B（PI3K-AKT）、肿瘤坏死因子（TNF）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和丝裂原活化蛋白激酶1/3（ERK）通路[31]。研究证实通过激活PI3K-AKT 信号通路能够使TNF 诱导的内皮细胞炎症反应减轻，从而保护KD 患者冠状动脉内皮细胞[32]。JNK 具有促进血管炎症的作用，持续的JNK通路激活会导致长期的慢性炎症，通过上调基质金属蛋白酶活性、细胞外基质代谢紊乱，导致KD 动脉瘤发生。因此JNK 可能成为KD 动脉瘤高危患者的新的治疗靶点[33]，值得进一步探索研究。HSPN 活动期导致肾脏足细胞凋亡从而检测到患者尿液中存在大量足细胞，而研究证实激活PI3K-AKT 信号通路可减少足细胞的凋亡，促进肾脏维持足细胞完整的结构和功能[34-35]。SLE 患者AKT 表达和磷酸化水平高于健康者提供的CD4+T 细胞则提示PI3K-AKT 信号通路活性上调[36]。此外，Molad Y 等[37]首次证实了ERK 和JNK 活性与人类SLE 疾病的活性呈正相关，若在疾病发展和活动期及时使用ERK 和（或）JNK 抑制剂可能对SLE 患者的治疗有益。

根据药物-成分-靶点-通路网络的结果分析，清瘟败毒饮中重要的有效成分包括槲皮素、芹黄素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、汉黄芩素等，在对KD、HSP、SLE“异病同治”中发挥着重要的潜在作用。如槲皮素是一种天然黄酮类，具有包括抗炎、抗氧化和神经保护等作用，已有研究表明槲皮素可能是KD、HSP、SLE 等炎症性疾病的潜在治疗候选药物[38-40]。芹黄素生物学效应主要是调节细胞周期、提高解毒酶效力、诱导细胞凋亡。乐纯琰等[41]通过网络药理学论证了芹黄素能够通过调控ALB、HSP90AA1、ESR1 等关键靶点，利用雌激素、NF-κB等信号通路的调控达到治疗SLE 的目的，为之后的实验研究奠定了理论基础。分子对接结果显示，槲皮素、芹黄素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、汉黄芩素与疾病主要靶点PPARG、CASP3、NFKBIA、MYC、IL-6 的结合活性强，在今后的基础试验中可探究这些化合物对KD、HSP、SLE 的作用机制，为临床治疗提供思路。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接技术，对清瘟败毒饮“异病同治”治疗KD、HSP 及SLE 的潜在靶点及有效成分预测、PPI 网络分析、GO和KEGG 富集分析，揭示清瘟败毒饮治疗KD、HSP、SLE 是一个涉及多靶点、多通路、多成分的复杂过程，其主要有效成分包括槲皮素、芹黄素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、汉黄芩素等，可能通过IL-6、VEGFA、PPARG、CASP3、HIF1A、EGFR、NFKBIA、ICAM1、MYC、FOS 等潜在核心作用靶点，作用于脂质与动脉粥样硬化等信号通路上。由于网络药理学主要通过对已有公开数据建立的网络预测模型，其数据库信息存在局限性，虽不能做到反映全部的药理学特点，但此研究可作为研究的基础，为进一步探讨清瘟败毒饮治疗KD、HSP 及SLE提供依据，也证实了中医“异病同治”理论的科学性。