不同植物精油对畜禽呼吸道致病菌的影响

■ 吴贵富

（丽珠集团新北江制药股份有限公司，广东清远 511520）

随着现代集约化、规模化养殖模式的兴起，加上季节性、地域性环境条件的变化，使得畜禽呼吸道感染成为畜禽主要的易患疾病之一[1]。常见的畜禽呼吸道感染中细菌感染是一个主要的诱因，引起细菌性支气管炎的细菌主要有流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌等。目前用于支气管炎临床治疗的抗菌药物主要有三大类：大环内酯类、β-内酰胺类和氟喹诺酮类化学药物，这些化学药物虽然对细菌性支气管炎都有治疗作用，但缺点也不可忽视，如易产生耐药性、药物易残留、药物副作用大、治疗费用高、易复发等。因此，国内外科研人员更多地将目光聚焦到效果稳定、副作用小、性价比高的植物抗菌剂上[2]。

植物精油是从植物中提取的油状液体的总称，具有一定的挥发性，广泛分布于植物中，可从花、叶、根、皮或整个植物中提取，是不溶于水但能溶于有机溶剂和脂类的芳香化合物，具有天然绿色、安全无残留、香味独特等优点。植物精油按化学成分分为四大类，以金合欢烯、茴香醇为主的萜类最常见；其次是芳香族化合物，含量在整个芳香族化合物中仅次于萜类，主要有酚类、醛类、酮类、酯类以及一些衍生物，如麝香草酚、桂皮醛等；第三类是脂肪族化合物，常见的有异戊醛、乙酸乙酯等，都是香茅精油中的一种；第四类是含氮、含硫的化合物，多存在于辛香料植物中，如洋葱中的三硫化物等[3-4]。不同成分的植物精油所发挥的作用和功能也不尽相同，常见有抑菌、杀虫、抗氧化、抗炎症和抗癌活性等功能，目前已广泛应用于农业杀虫剂、食用香精、食品保鲜防腐剂、化妆品以及医疗等领域[5]。其中，植物精油的抑菌功能应用最为广泛。植物精油具有优良的抑菌效果，在国内外众多研究报道中均得到验证，从替抗理念提出以来，人们一直没有停止对植物精油抑菌效果的探索，何楚俐等[6]在不同种类的植物精油体外抑菌效果的研究中表明，多种植物精油（如香芹酚等）均对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑菌作用，张林会等[7]、张桂枝等[8]、黄梓炜等[9]、吴雨泉等[10]都从不同的试验中表明，适宜的植物精油对不同的致病菌均有较好的抑菌效果，因此，筛选适宜的植物精油品种，开发好的替抗产品，并应用到畜禽日常生产养殖中，是一个具有良好前景的替抗发展方向，然而目前植物精油应用于畜禽呼吸道感染方面的研究相对较少。本试验从绿色、安全、环保、有效的目的出发，运用天然的植物精油代替部分抗生素使用，防治常见的畜禽细菌性呼吸道感染疾病。通过体外平板打孔抑菌试验、正交试验以及动物试验，在17 种天然植物精油中系统地筛选出对畜禽细菌性呼吸道感染常见致病菌有较好抑菌效果的精油品种及其组合，并通过动物试验确定适宜的添加剂量，为植物精油对家禽养殖中细菌性呼吸道疾病的防治奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

LB培养基条件：pH为7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。

材料：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉（均购自杭州百思生物技术有限公司）、去离子水由Smart-R15U超纯水仪（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）实验室自制。

指示菌：沙门氏菌（CVCC2218）、金黄色葡萄球菌（CVCC2257）来源于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，乙型溶血性链球菌[CMCC（B）32210]、大肠杆菌（CGMCC1.1252）来源于上海保藏生物技术中心。

植物精油：大蒜油、薄荷精油、迷迭香精油、柠檬精油、桉叶精油、牛至油、丁香精油、艾叶油、柠檬香茅草油、生姜精油、薰衣草油、乳香油、百里香酚、薄荷脑、茶树精油购自深圳市国鑫香精香料有限公司，肉桂醛、香芹酚购自吉安博锐香料油有限公司，精油含量范围均在95.0%～99.9%。

1.2 试验动物及处理

试验动物：取体重相近、健康状况良好、雌雄各半的40日龄清远麻鸡75只（购自清远市三源清远鸡养殖有限公司），对其中60只受试鸡均用1×106CFU/mL 浓度的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌接种液进行气囊攻毒感染，经毒力测定及临床症状表现，最终选用4 种接种液各0.5 mL 作为每只受试鸡的攻毒剂量。

感染模型建立：攻毒感染24 h 后，受试鸡出现气喘、咳嗽、食欲不振等呼吸道临床症状，即建立受试鸡感染模型。

1.3 试验设备

主要仪器有SW-CJ-2FD 净化工作台（上海昕仪仪器仪表有限公司）、BPP-7800 pH 仪[贝尔分析仪器（大连）有限公司]、WH-2 微型旋涡混合仪（常州市中贝仪器有限公司）、BKQ-B50Ⅱ立式压力蒸汽灭菌锅（山东博科医疗器械有限公司）、RW-2102C 双层恒温培养振荡器（上海瑞稳仪器设备厂）、SPX-80E智能型生化培养箱（上海靳澜仪器制造有限公司）、DHG-9023A烘干箱（上海善志仪器设备有限公司）等。

1.4 单一植物精油对不同致病菌体外抑菌效果筛选

以1×106CFU/mL 0.1 mL的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌作为指示菌，均匀涂抹在LB 固态培养基上，试验分为两组，每组分别在同一平板、同一培养基、同一培养条件下，加入不同种类精油10 μL，培养24 h 后，用游标卡尺测量抑菌直径，评判其抑菌性，筛选效果最佳的几种精油，具体方法见1.7.1。

1.5 复合精油对不同致病菌体外抑菌效果筛选

将筛选出的精油按照2：1、1：1、1：2 不同比例复合后，分别加入大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌作为指示菌的培养基中，具体方法同1.4。通过正交试验，确定最佳抑菌效果的精油组合。

1.6 最小抑菌浓度筛选

以2 倍稀释法筛选出最佳抑菌作用精油及精油组合的最小抑菌浓度的最小抑菌圈直径（MIC）。

1.7 测定方法和指标

1.7.1 植物精油抑菌筛选

选取畜禽呼吸道感染致病菌作为指示菌体，通过抑菌圈的大小筛选出效果最佳的几种植物精油和精油组合。运用滤纸片法对不同种类植物精油和复配精油进行抑菌试验。

抑菌试验：滤纸片法测定抑菌作用。将灭菌后的LB 固态培养基按15～20 mL 每皿倒入培养皿中，置于超净工作台上。冷却凝固后，在培养基中取菌原液（1×106CFU/mL）0.1 mL，均匀涂抹，然后在含菌的平板上贴上无菌滤纸片，每个培养皿3 张，呈三角形。然后将10 μL 的精油滴入每个滤纸片的中间，每个精油做3 次平行重复。同时设置空白对照，无需精油处理。待精油完全被滤纸片吸收后，在37 ℃的生化培养箱中翻转放入培养皿中，24 h后记录结果。

1.7.2 不同植物精油的最小抑菌浓度

将筛选好的植物精油进行复配，筛选出抑菌效果最好的精油复配组合，并判定出植物精油和复合精油的最小抑菌浓度。

2倍稀释法：取灭菌试管若干，在第1个试管中加入2 mL精油或复合精油，其余试管加入1 mL液体培养基，1号试管中无水乙醇含量为2%，用以乳化精油，此无水乙醇浓度对菌种无明显抑菌作用。取1 mL 1号试管精油混合液体加入到2号试管中，依次类推，做梯度稀释，直到11号试管，向其中加入1 mL去离子水，作为阴性对照。最后，在每个试管中分别加入0.5 mL液体培养基和菌液，使最终浓度依次为50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.098 mg/mL，37 ℃，24 h后观察试管溶液菌种变化。

MIC 判定标准：以阳性管溶液浑浊、阴性管溶液澄清的含菌表现，以此来指示细菌的MIC值。

1.7.3 动物试验

将60只感染模型受试鸡平均分成4组，每组15只，未攻毒感染的15 只受试鸡为空白组，每组3 个重复，每个重复5 只，即空白组、对照组和高、中、低三个剂量组，剂量组为前期体外抑菌试验筛选出的、抑菌效果最佳的复合植物精油（肉桂醛∶百里香酚2∶1），具体见表1。保持在同一光照和饲养环境下，自由采食和饮水，连续饲喂7 d，观察记录各组受试鸡的临床症状、死亡情况和采食情况。

表1 动物试验设计

1.8 数据统计与分析

测试数据由SPSS 19.0 统计软件进行分析，试验结果以平均值表示。测定抑菌的标准：抑菌圈直径在20 mm 以上的具有极强的敏感性；直径为15～20 mm的为高敏；直径10～15 mm 的为中敏；7～10 mm 的为低敏；7 mm以下的为不敏感。

2 结果与分析

2.1 不同精油对畜禽呼吸道致病菌的体外抑菌效果

从表2中可以看出，在测试的17种精油中，对大肠杆菌抑制效果最好的是肉桂醛，其次是香芹酚、牛至油、茶树精油、百里香酚、丁香精油；对沙门氏菌抑制效果最好的是肉桂醛，其次是牛至油、香芹酚、百里香酚、丁香精油、茶树精油；对金黄色葡萄球菌抑制效果最好的是肉桂醛，其次是香芹酚、牛至油、百里香酚和茶树精油；肉桂醛对乙型溶血性链球菌抑制效果最好，香芹酚次之，其次为牛至油、大蒜油、百里香酚、茶树精油、柠檬香茅草油。

表2 不同精油对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌的体外抑菌效果

2.2 不同比例复合精油对畜禽呼吸道致病菌的体外抑菌效果

由单一植物精油抑菌试验得出肉桂醛、香芹酚、百里香酚、牛至油等对畜禽呼吸道致病菌有较好的抑菌效果，通过正交试验得出不同比例复合精油对畜禽呼吸道致病菌的抑制效果。由表3 可知，精油组合中抑制大肠杆菌效果最好的是2∶1的肉桂醛∶牛至油，其次是2∶1的肉桂醛∶百里香酚、1∶2的肉桂醛∶香芹酚、2∶1的香芹酚∶牛至油、2∶1的肉桂醛∶香芹酚、1∶1的肉桂醛∶牛至油；精油组合中抑制沙门氏菌效果最好的是2∶1的肉桂醛∶百里香酚，其次是2∶1的肉桂醛∶香芹酚、2∶1 的肉桂醛∶牛至油、2∶1 的香芹酚∶百里香酚、1∶1的肉桂醛∶牛至油；精油组合中抑制金黄色葡萄球菌效果最好的是2∶1 的香芹酚∶牛至油，其次是2∶1 的肉桂醛∶百里香酚、2∶1 的肉桂醛∶香芹酚组合、2∶1 的香芹酚∶百里香酚、2∶1的肉桂醛∶牛至油组合以及1∶2 的香芹酚∶百里香酚和1∶1的肉桂醛∶牛至油；对乙型溶血性链球菌抑菌效果最好的精油组合为2∶1 的肉桂醛∶牛至油组合，其次为2∶1、1∶1的肉桂醛∶百里香酚。

表3 不同比例复合精油对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌的体外抑菌效果(mm)

2.3 对畜禽呼吸道致病菌最具抑菌效果的植物精油及精油组合的最小抑菌浓度

由表4 可知，单个植物精油肉桂醛和香芹酚对畜禽呼吸道感染常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.391 mg/mL，对乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度均为0.781 mg/mL。精油组合中2∶1 的肉桂醛∶牛至油对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.195 mg/mL，对大肠杆菌、乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度均为0.391 mg/mL；2∶1的肉桂醛∶百里香酚对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.195 mg/mL，对乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度为0.391 mg/mL。

表4 不同精油及精油组合的最小抑菌浓度（mg/mL）

2.4 动物试验结果

由表5可知，当2∶1的肉桂醛∶百里香酚复合精油的用量为100 mg/kg时，治愈率为53.33%；当用量为200 mg/kg时，治愈率为86.66%；当剂量加至300 mg/kg时，观察到个别试验鸡有精神状态不佳现象，并出现死亡情况，故将此浓度定为高剂量限度。综合试验结果，当2∶1 的肉桂醛∶百里香酚复合精油的用量为200 mg/kg时，可达到最佳的抑菌效果。

表5 2∶1的肉桂醛∶百里香酚对畜禽细菌性呼吸道感染的治疗效果（n=15）

3 讨论

3.1 不同精油对畜禽呼吸道致病菌的体外抑菌效果

通过对市面上抑菌效果较好的17 种植物精油进行畜禽呼吸道感染常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌的抑菌试验，试验结果表明，筛选出有较好抑菌效果的植物精油是肉桂醛，其次是香芹酚、牛至油和百里香酚，这与相关研究表述一致。顾仁勇等[11]在对肉桂精油进行抑菌试验研究时指出，在对真菌和酵母菌有强烈抑制作用的同时，肉桂精油对细菌的抑菌作用显著。郭新春等[12]在20 种中药精华抑菌活性研究时显示，肉桂、丹皮萃取精华有较好的抑菌效果。王改琴等[13]在研究不同植物精油的体外抑菌作用时指出，肉桂醛、香芹酚、丁香精油、百里香酚等对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有较好的抑菌作用。

3.2 不同比例复合精油对畜禽呼吸道致病菌的体外抑菌效果

试验结果表明，筛选出的单一植物精油在进行正交试验后，表现出对畜禽呼吸道感染常见致病菌综合抑菌效果较好的植物精油组合是2：1 的肉桂醛：牛至油以及2：1 的肉桂醛：百里香酚。复合精油抑菌效果优于单一植物精油抑菌效果，这与相关研究资料表述一致，但具体机制尚不明确，根据相关报道，可能与植物精油之间的协同作用和混合物生物多样性的增加有关。郝文凤等[14]在植物精油协同抑菌的研究进展中表明，与任何单一的精油相比，不同精油组成的精油混合物可能具有更强的抗菌性能，这可能与混合物生物多样性的增加有关。吴克刚等[15]在8种植物精油对常见微生物体外抑菌效果的研究中表明，肉桂醛与牛至油复合精油有着非常显著的协同抑菌效果。同时，Sae-Eawa 等[16]也在相关试验中表明，适宜比例复合后的植物精油，均表现出强烈的协同抑菌效果。

3.3 不同精油及精油组合对畜禽呼吸道致病菌的最小抑菌浓度

在本试验结果中，单个植物精油肉桂醛和香芹酚对畜禽呼吸道感染常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.391 mg/mL，对乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度均为0.781 mg/mL。精油组合中2∶1的肉桂醛+牛至油对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.195 mg/mL，对大肠杆菌、乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度均为0.391 mg/mL；精油组合中2∶1的肉桂醛+百里香酚对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.195 mg/mL，对乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度为0.391 mg/mL。这与相关试验结果相近，但略有不同。黄洒[17]在对不同复配精油的抑菌试验中表明，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、黑曲霉和产黄青霉，肉桂精油对所有菌种都具有较强的抑制作用，其次是丁香精油和百里香精油。赵丹等[18]在对金黄色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌4 个菌种进行肉桂精油抑菌试验中，分别显示出200、200、200、400 μL/mL的最小抑菌浓度。

3.4 复合植物精油对畜禽呼吸道病的临床治疗效果

动物试验结果显示，在对鸡呼吸道感染常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌攻毒模型的动物试验中，高、中、低三个剂量组与对照组相比，均有不同程度的治疗效果，在2∶1 的肉桂醛∶百里香酚复合精油200 mg/kg 剂量时，治疗效果最好。同时，相关研究报道，不同种类复合精油还对鸡的产蛋率和生产性能和肠道菌群有促进作用。杨建平等[19]在对复合植物精油对蛋鸡生产性能、蛋品质和肠道菌群结构的影响试验中发现，饲喂时添加150 mg/kg 复合植物精油，能提高蛋鸡的生产性能和蛋黄质量，增加盲肠拟杆菌门丰度。因此，适量、适宜的复合植物精油，可对畜禽的细菌性呼吸道感染和产蛋性能等方面起到积极的效果。

4 结论

在17 种优选植物精油对畜禽呼吸道感染常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌的抑菌试验结果表明，抑菌效果最佳的单一植物精油为肉桂醛和香芹酚，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.391 mg/mL，对乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度均为0.781 mg/mL。抑菌效果最佳的植物精油组合为2∶1 的肉桂醛∶牛至油和2∶1的肉桂醛∶百里香酚，2∶1的肉桂醛∶牛至油对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.195 mg/mL，对大肠杆菌、乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度均为0.391 mg/mL；2∶1 的肉桂醛∶百里香酚对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.195 mg/mL，对乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度为0.391 mg/mL；在对鸡大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌呼吸道感染动物模型试验中，2∶1的肉桂醛∶百里香酚最佳的治疗剂量为200 mg/kg。