发酵沙柳对西门塔尔后备母牛瘤胃发酵参数及微生物多样性的影响

■ 王 超 田 丰 李九月 李长青 王 利 张海鹰 薛树媛

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031）

沙柳（Salix psammophila）为多年生沙生灌木，因其具有抗旱、耐贫瘠、耐严寒、抗风沙等特性，成为我国重要的防风固沙树种，也是我国三北防护林首选树种。由于沙柳含有丰富的营养物质和钙、磷等矿物质元素，逐渐成为我国北方地区重要的粗饲料资源。薛树媛[1]在对不同生长期沙柳营养成分的研究中发现，其粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤性纤维（ADF）含量分别为6.3%～10.1%、32.4%～52.7%、30.9%～33.7%，体外瘤胃培养法测定沙柳粗蛋白的平均降解率为63.1%。崔瑞梅[2]报道，用尼龙袋法测定沙柳的粗蛋白降解率为68.9%，干物质降解率为38.7%，粗纤维降解率57.2%。李满双等[3]研究发现，发酵沙柳在体外培养中可以显著提高瘤胃液微生物蛋白（MCP）和总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度，而且能降低瘤胃液pH、氨态氮（NH3-N）浓度、丁酸浓度以及乙酸/丙酸值，因此推断沙柳具有较高的饲用价值，与许冬梅等[4]的研究结果一致。发酵饲料既可以有效保留饲料的营养成分，还可以长期贮存、不发生变质，而且发酵还可以提高饲料的消化利用率。王超等[5]研究表明，发酵全混合饲料在体外瘤胃培养中，可以促进瘤胃发酵，提高干物质、中性洗涤纤维降解率以及瘤胃纤维降解菌数量。因此，沙柳在饲喂过程中也采取发酵后再饲喂。而关于发酵沙柳对于肉牛生长性能、瘤胃发酵特性以及瘤胃微生物群影响的研究还未见报导。本研究用发酵沙柳饲喂西门塔尔母牛，探讨其对瘤胃发酵特点和瘤胃微生物多样性的影响。

1 材料和方法

1.1 发酵沙柳的制作

2020 年10 月中旬收割沙柳，并利用揉丝粉碎机（9ZR-2.6，沧州昌鸿磨浆机械有限公司）将沙柳揉丝粉碎为2～3 cm 的丝段，添加适量的玉米粉、麸皮、糖蜜、青贮发酵剂，调节水分含量在55%左右，充分混合搅拌后，制作成裹包青贮，置于阳光房中发酵30 d待用。

1.2 全混合日粮的配制

根据肉牛生长需要量，结合燕麦秸秆、发酵沙柳、玉米秸秆黄贮营养含量，配制燕麦秸秆和发酵沙柳全混合日粮，日粮组成及营养水平见表1。

1.3 试验牛的选择

选择18 头体重为270～280 kg、生长状况良好的12 月龄西门塔尔后备母牛，对所有牛进行统一编号、驱虫免疫，其他管理措施按照牛场管理进行。将18头牛随机分为2组，每组9头牛。

1.4 试验设计与饲养管理

试验在内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗桑格达来镇查干淖尔家庭牧场进行，试验时间为2020 年11 月—2021 年1 月，其中预试期10 d，试验期55 d，对照组饲喂燕麦秸秆、玉米秸秆黄贮以及精饲料配制成全混合饲料，试验组饲喂燕麦秸秆、发酵沙柳以及精饲料配制成全混合饲料。试验期间每日07：00和18：00按照10～12 kg/头的量投料，保证每天采食后料有剩余，试验牛自由采食和饮水。

1.5 样品采集与处理

用经口投胃管式瘤胃液采集装置采集瘤胃液。将采集的瘤胃液分装为3份，一份取8 mL放入预先加入2 mL 25%偏磷酸的15 mL 离心管中，测定瘤胃液中挥发性脂肪酸（VFA）含量；另取2份置于5 mL螺口离心管中，分别测定瘤胃液NH3-N、MCP 含量和瘤胃微生物多样性。运输过程中瘤胃液用液氮保存，带回实验室后-80 ℃冰箱保存。

1.6 测定指标

1.6.1 瘤胃发酵指标

NH3-N 含量按照冯宗慈等[6]的比色法测定，VFA含量参照王超等[5]的方法测定，MCP 含量应用考马斯亮蓝比色法测定[7]。

1.6.2 瘤胃微生物群态分布

1.6.2.1 瘤胃液细菌DNA的提取

将-80 ℃保存的瘤胃液样品置于无菌操作台，并放入冰水混合物中解冻后，利用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit（Omega Bio-Tek公司，美国）提取瘤胃液中总DNA。用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量，同时采用紫外分光光度计对DNA 进行定量，确认DNA纯度。

1.6.2.2 PCR扩增

在V3～V4 区 域 利 用 引 物341F（5′-CCTAC‐GGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGG‐TATCTAATCC-3′）进行PCR 扩增，反应条件为98 ℃预变性30 s，98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环后，72 ℃延伸10 min。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）纯化、Qubit（In‐vitrogen，USA）定量。

1.6.2.3 PCR产物序列测定及分析

PCR 产物在Illumina NovaSeq（LC-Bio 公 司，美国）平台上进行测序（杭州联川生物技术股份有限公司）。利用QIIME2 计算出超指数（Chao）、物种数目（observed species）、覆盖度（goods coverage）、香浓指数（Shannon）、辛普森指数（Simpson）5 个指标。采用BLAST 进行序列比对，每个代表性序列用SILVA 数据库对特征序列进行注释。

1.7 数据分析

数据分析均利用Microsoft Excel 2019 软件对试验数据进行分析整理并制作图表，同时采用SPSS 17.0 统计学软件对数据进行单样本的t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 发酵沙柳对牛瘤胃液发酵指标的影响

由表2 可知，CK 组瘤胃液pH、NH3-N 含量低于SP 组，但均无显著差异（P>0.05）。CK 组和SP 组的MCP 含量分别为3.34 mg/dL 和3.10 mg/dL，CK组显著高于SP 组（P<0.05）。CK 组瘤胃液中VFA、乙酸、丙酸、丁酸含量以及乙酸/丙酸值都高于SP组，但均无显著性差异（P>0.05）。

表2 饲喂不同日粮对牛瘤胃液发酵参数的影响

2.2 发酵沙柳对牛瘤胃微生物多样性的影响

2.2.1 Alpha多样性指数

由表3 可知，两组超指数分别为1 410 和2 035，SP 组显著高于CK 组（P<0.05）；两组之间的香浓指数分别为9.48 和9.71；辛普森指数分别为0.85 和0.81；覆盖度分别为0.995 和0.989。香浓指数、辛普森指数和覆盖度两组间均无显著差异（P>0.05）。

表3 饲喂不同日粮对牛瘤胃细菌alpha多样性指数的影响

2.2.2 瘤胃细菌操作分类单元（OTU）分布维恩（Venn）图以及瘤胃细菌组成

由饲喂不同日粮的肉牛瘤胃液细菌OTU 数量Venn 图（图1）可知，CK 组的OTU 数量为1 410 个，SP组的OTU数量为2 015个，SP组OTU数量高于CK组，CK和SP共同OTU数量为333个。

图1 瘤胃细菌OTU分布Venn图

瘤胃微生物细菌在门水平共检测到20 个细菌门，见图2 和表4。厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）属于优势菌门，Firmicutes 的相对丰度分别为47.75%和76.78%，CK 组极显著低于SP 组（P<0.01），Bacteroidetes 的 相 对 丰 度 分 别 为32.68% 和19.05%，CK 组有高于SP 组的趋势，但无显著差异（P>0.05）。而变形菌门（Proteobacteria）、Kiritimatiellaeo‐ta、纤维杆菌门（Fibrobacteres）和Patescibacteria 是CK组中相对丰度高于1%的菌门，有高于SP 组的趋势，但与SP组均无显著差异（P>0.05）。

表4 饲喂不同日粮对母牛瘤胃微生物多样性的影响（%）

瘤胃微生物细菌在属水平共检测到218 个（见图3），相对丰度排名前20 的属见表4。CK 组和SP 组的Christensenellaceae_R-7_group 的相对丰度分别为4.99%和24.95%，SP 组显著高于CK 组（P<0.05）。CK组和SP 组的Prevotella_1 相对丰度分别为11.81%和0.71%，SP 组显著低于CK 组（P<0.05）。SP 组理研菌属和瘤胃菌属相对丰度分别为9.80%和8.93%，有高于CK 组的趋势，但无显著差异（P>0.05）。CK 组Fi⁃brobacter、Ruminococcaceae_UCG-001、Succinivibriona⁃ceae_UCG-002、Bacteroidales_RF16_group_unclassified相对丰度高于SP组，无显著差异（P>0.05）。

图3 瘤胃菌群属水平结构组成柱形图

3 讨论

3.1 发酵沙柳对瘤胃液发酵指标的影响

瘤胃液pH 是反刍动物瘤胃发酵水平的评价指标，pH 对瘤胃发酵至关重要。Qin等[8]研究发现，瘤胃液pH 在 6.60～6.80 可以保持适宜的纤维消化环境，如果日粮全是粗饲料，并且粗饲料中NDF 含量高，pH 变动范围为 5.0～7.8。本试验中，CK 组和SP 组瘤胃液pH 分别为6.82 和6.89，两组之间无显著差异，而且都处于pH 的正常变动范围内，说明饲喂发酵沙柳与普通饲料一样，对肉牛瘤胃液pH 没有显著影响。瘤胃微生物将饲料中的蛋白质和非蛋白氮降解为NH3-N，其中一部分又被瘤胃微生物利用，合成菌体蛋白[9]。瘤胃中NH3-N 浓度是瘤胃中微生物对日粮中氮源的消化利用情况的反映，也是蛋白质降解与菌体蛋白合成之间平衡关系的反映[10-11]。瘤胃微生物生长的最适合NH3-N 浓度为6.3～27.5 mg/dL[12]。菌体蛋白是瘤胃微生物利用NH3-N能力的反映，VFA由饲料中碳水化合物降解产生，为反刍动物提供总能量的70%～80%[13]。本试验中，CK 组和SP 组NH3-N 浓度分别为11.92 mg/dL 和13.54 mg/dL，都属于正常范围内。SP 组MCP 含量显著低于CK 组，SP 组与CK 组的TV‐FA、乙酸、丙酸含量均无显著性差异，表明发酵沙柳的饲喂对于肉牛瘤胃内VFA 的生成无明显的影响。本试验中，pH、NH3-N 浓度、MCP 含量以及TVFA 含量均与李满双等[3]体外培养结果不同，可能是由于体外培养在稳定的环境中进行，而动物饲喂时环境条件较恶劣，环境温度最低时达-40 ℃低温，冷应激导致体内外结果的差异。

3.2 发酵沙柳对瘤胃微生物的影响

3.2.1 发酵沙柳对alpha多样性指数的影响

Chao 指数是估计群落中含OTU 数目的指数，常用来估计物种总数，Shanno和Shimpson可反映瘤胃菌群的多样性，Shanno 值越大群落多样性越高；Shimp‐son 值越大群落多样性越低。本试验中，SP 组Chao 指数显著高于CK 组，Shanno 有高于CK 组的趋势，Shimpson 值有低于CK 组的趋势。都表明发酵沙柳饲料的饲喂可以提高肉牛瘤胃微生物种的数量，增加瘤胃微生物多样性的丰度。覆盖度是对测序结果是否能真实反映样本中微生物情况的说明，其数值越大说明样本序列被测出的概率越大，未被测出的概率越小，一般覆盖度高于97%时说明测序样品取样充分。本试验中，CK 组和SP 组的覆盖度分别为0.995%和0.989%，可以认为该测序结果能覆盖瘤胃中大部分细菌群落，能很好地反映瘤胃微生物种类和结构。

3.2.2 发酵沙柳对瘤胃细菌OTU 分布Venn 图和瘤胃微生物多样性的影响

Venn 图可以比较直观地反映样本的OTU 数、组成的相似性以及相互间的重叠情况。SP 组瘤胃细菌OTU 数量高于CK组，而且两组之间差异比较大，说明发酵沙柳可以提高肉牛瘤胃细菌多样性。

瘤胃微生物对反刍动物营养代谢和健康发挥着重要作用，其种类和数目受饲粮结构的影响[14]。有研究表明，拟杆菌门与厚壁菌门是反刍动物瘤胃中的优势菌门[15-16]，成熟反刍动物瘤胃中主要细菌相对丰富度：厚壁菌门56%、拟杆菌门31%、变形菌门4%[17-18]。厚壁菌门主要参与纤维物质的分解，与乙酸和乳脂的生成及脂肪的沉积密切相关；拟杆菌门是降解碳水化合物的主要细菌，与瘤胃中丙酸的生成具有正相关关系。两者在瘤胃发酵过程中起着至关重要的作用[19]。本试验中，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacte‐roidetes）属于CK 组和SP 组的优势菌门，且SP 组厚壁菌门（Firmicutes）丰度极显著高于CK 组。本试验结果与前人的结果一致，说明饲喂发酵沙柳不影响瘤胃优势菌门，而且可以显著提高厚壁菌门相对丰度。有研究表明，厚壁菌门（Firmicutes）与肥胖有关，消化系统内厚壁菌门增多会使机体吸收更多的能量，堆积大量的脂肪[20]；拟杆菌门能分解日粮中的糖类和蛋白质类大分子物质，协助宿主利用机体不能消化的多糖，提高对营养物质的消化吸收效率，增加育肥效果[21]。除以上两门以外，CK 组相对丰度高于1%的菌门有变形菌门（Proteobacteria）、Kiritimatiellaeota、纤维杆菌门（Fibrobacteres）和Patescibacteria；SP 组中除厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门外，其他菌门相对丰度均低于1%。

在属水平上，克里斯滕斯内拉菌（Christensenella⁃ceae_R-7_group）属于厚壁菌门，可以利用各种糖类，产生挥发性脂肪酸，与机体代谢健康密切相关[22]。本试验中，Christensenellaceae_R-7_group 是SP 组优势菌属，且显著性高于CK组，说明饲喂发酵沙柳可以促进Christensenellaceae_R-7_group的增殖。普雷沃氏菌属（Prevotella_1）属于拟杆菌门，主要参与饲粮中的半纤维的降解，并且能够产生大量的复合酶，有促进非纤维性多糖和蛋白质的降解作用[23]。霍俊宏等[24]和陈芸等[25]研究发现，随着饲粮精粗比的提高，山羊瘤胃普雷沃菌属丰度呈上升的趋势。本试验中，普雷沃氏菌属是CK 组的优势菌属，其丰度显著高于SP 组，与霍俊宏等[24]和陈芸等[25]的研究结果不同，可能是由于他们的试验中对照组采用的燕麦秸秆和玉米青贮与发酵沙柳相比，半纤维素高于SP 组，利于普雷沃氏菌属的增殖。

4 结论

发酵沙柳饲喂生长期母牛，降低了瘤胃液菌体蛋白含量，提高肉牛瘤胃微生物种的数量，增加瘤胃微生物多样性的丰度，显著提高厚壁菌门丰度。