大菱鲆弧菌快速检测方法的建立和应用

王菁，刘群，韩进刚，徐赟霞，王钢

（1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；2.天津市水产研究所，天津 300221）

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是原产自我国近海的优良海水鱼类品种，是继牙鲆和大菱鲆之后的又一个鲆鲽类养殖品种。随着养殖业的发展，半滑舌鳎养殖过程中的病害问题也日趋严重，主要包括烂尾病、皮肤溃疡病、腹水病、肠炎、脓肿病、结节病、红遍病及寄生虫病等[1]。近几年，在天津工厂化鲆鲽类养殖过程中，出现一种腹水病，其主要的症状为腹部肿大，打开腹腔后，发现肠道呈透明状，内无食物且有大量无色或淡黄色积液，而且积水聚集在肠道无法排出体外；观察其他内脏器官无明显病变。该病在半滑舌鳎各个养殖阶段均有发现，具有发病率高、传播速度快的特点[2]。仔稚鱼和10 cm 以下的苗种感染该病后，日死亡率在2‰左右，但由于该疾病持续时间长，累积死亡率可超过50%。跟踪调查显示，大菱鲆弧菌是该病的主要致病原之一。

目前，针对细菌性病原的检测方法主要为细菌分离+生化鉴定。传统细菌分离鉴定方法具有检测时间长、工作量大、准确度不高的特点[3]。对于急性感染的病例，往往会错过最佳治疗时间。PCR 检测技术具有特异性强、反应迅速、灵敏度高的特点，本研究利用该检测技术建立了大菱鲆弧菌的快速检测方法，节约了检测时间和检测成本，在鲆鲽类健康养殖和产业发展的生物安全监控中具有重要意义[4]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

哈维氏弧菌（Vibro harveyi）、鳗弧菌（Vibro anguillarum）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、副溶血弧菌（Vibro parahaemolyticus）、大菱鲆弧菌（Vibrio scophthalmi）、溶藻弧菌（Vibro alginolyticus）和创伤弧菌（Vibrio vulnificus）由实验室保存；临床样品收集自2017—2021 年天津地区工厂化养殖场。

海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，批号W9819）、细菌基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，批号X1205），天根生化科技（北京）有限公司；PCR 体系试剂，宝生物工程（大连）有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、脑心浸液培养基（BHI），英国OXOID 公司；PCR 引物合成于金唯智生物科技有限公司。

ProFlex PCR 扩增仪，美国ABI 公司；DYY-12型电泳仪，北京市六一仪器厂；Gel DOC XR+凝胶成像分析系统，美国BIO-RAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提 供的大菱鲆弧菌luxr 基因序列，利用Primer Premier 5软件进行引物设计，共设计特异性引物2 对，分别记为luxr192、luxr130。

1.2.2 细菌基因组制备

从-80 ℃超低温冰箱中取出上述菌株，置于4 ℃融化后，取50 μL 菌液进行划线培养，28 ℃培养18 ～24 h。挑取单菌落接种于液体TSB 培养基中，28 ℃过夜培养。取1 mL 菌液进行离心，弃上清，沉淀用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取菌体的基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.3 引物筛选

随机选取实验室菌株大菱鲆弧菌（598、180314、180315）、哈维氏弧菌（691）、迟缓爱德华氏菌（370）、副溶血弧菌（150）、溶藻弧菌（646）、创伤弧菌（611）基因组DNA 用作PCR 的模板，利用TIANGEN2×Taq PCR 预混试剂验证引物的特异性。引物筛选所用的PCR 反应体系和PCR 反应程序见表2、表3。

表1 引物序列

表2 PCR 反应体系

表3 PCR 反应程序

1.2.4 PCR 反应体系和反应程序的优化

以TIANGEN2×Taq PCR 预混试剂提供的体系为基础，建立PCR 反应体系和PCR 反应程序。以建立的多重PCR 反应体系和PCR 反应程序为基础，每次设置一个变量，固定其他变量，根据电泳条带亮度，筛选变量数据作为最终结果。在退火温度为58 ℃的条件下，设置5 个引物浓度梯度（0.10 μmol/L、0.25μmol/L、0.50 μmol/L、1.00 μmol/L、1.50 μmol/L），进行引物浓度筛选；在筛选出的引物浓度条件下，设置6 个退火温度梯度（54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃）进行退火温度优化，最终得到优化好的PCR 反应体系和PCR 反应程序。

1.2.5 灵敏度、特异性测试和准确性测试

（1）灵敏度：本研究利用每次PCR 反应中能检测出的最少菌数来反映PCR 的灵敏度，即CFU/反应。将大菱鲆弧菌（598）从-80 ℃超低温冰箱中取出，在BHI 琼脂平板上进行划线接种，28 ℃倒置培养。然后挑取单菌落转接于液体TSB 培养基，28 ℃、170 r/min，振荡培养过夜。培养好的菌液依次进行10倍比稀释，共稀释10 个梯度。将稀释后的菌液涂布于BHI 琼脂平板，每个稀释度涂3 块，28 ℃倒置培养。24 h 后菌落计数，计算出菌液原浓度，选取浓度在109CFU/mL 的菌液为灵敏度检测的原始菌液。将原始菌液进行10 倍比稀释，得连续10 个梯度的稀释液，利用TIANGEN 细菌基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，50 μL 洗脱液洗脱。利用建立好的PCR 反应体系和反应程序，根据扩增条带的亮度来判定检测方法的灵敏度。

（2）特异性：利用目前实验室掌握的病原（寄生虫、细菌、病毒）进行该方法的特异性测试。15 种病原主要包括病毒性神经坏死病病毒、大鲵虹彩病毒、中华鳖虹彩病毒、坏鳃指环虫、鳙指环虫、小鞘指环虫、页形指环虫、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、肝肠胞虫、哈维氏弧菌和迟缓爱德华，均由实验室保存。

（3）准确性：随机选取实验室采集的24 个样品，同时利用16S rDNA 序列分析[4]和已建立的PCR方法进行检测，从而评价该方法的准确性。细菌16S rDNA 序列分析方法为，利用通用引物27F 和1492R对提取的细菌基因组进行扩增，取5 μL 的PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。反应体系为50 μL，包 括27F（10 μmol/L）1 μL，1492R（10 μmol/L）1 μL，2×Taq PCR MasterMix Ⅱ 25μL，RNase-Free H2O 21 μL，模板2 μL。反应条件为95 ℃、5 min；95 ℃、1 min，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 个循环；72 ℃、10 min；4 ℃保温。

1.2.6 大菱鲆弧菌流行病学调查

收集2017—2021 年天津地区工厂化养殖鱼类样品131 个，用上述已建立的方法进行病原检验，掌握天津地区大菱鲆弧菌的感染情况，为天津市苗种引进和筛选提供技术数据支撑。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

利用TIANGEN2×Taq PCR 预混试剂验证引物的特异性，从而筛选出特异性高的引物序列。如图1 所示，利用luxr192 引物扩增创伤弧菌时，出现900 bp左右的条带，为保证检测结果的准确性，尽量避免无效条带的扩增，最终选择luxr130 引物作为大菱鲆弧菌PCR 检测方法的引物。

图1 引物筛选电泳结果

2.2 PCR 反应体系和反应程序的建立与优化

以表2 的成分为基础，进行引物浓度、退火温度的优化，最终获得PCR 反应体系和反应程序见表4、表5。

表4 优化后的PCR 反应体系

表5 优化后的PCR 扩增程序

2.3 灵敏度测试

利用涂布计数的方法，确定适合的菌液浓度为1.37×109CFU/mL，并进行10 倍比梯度稀释。提取细菌DNA 为模板，进行灵敏性测试。如图2 所示，当菌液浓度为104CFU/mL 时，扩增效率明显减弱，目的条带变暗；当菌液浓度为103CFU/mL 时，能够清晰看到电泳条带；当菌液浓度为102CFU/mL 时，目的片段模糊。因此，建立的PCR 检测方法的检出限为103CFU/mL。

图2 灵敏度测试结果图

2.4 特异性测试

特异性测试结果显示，该方法特异性良好，没有扩增出其他病原，详见图3。

图3 特异性测试结果图

2.5 准确性测试

如图4 所示，利用已建立的方法对24 个样品进行准确率测试，共检出大菱鲆弧菌17 株，与常规16S rDNA 检测方法[4]的结果相同，准确率为100%，表明该方法准确可靠。

图4 准确率测试结果图

2.6 天津地区工厂化养殖鱼类大菱鲆弧菌流行病学调查

利用上述方法对实验室收集到的131 个样品进行病原检验，共检出大菱鲆弧菌38 株，检出率29%。利用16S rDNA 分析比对，两者结果完全相符。将检测结果反馈给养殖企业，可为苗种引进和疾病防控提供技术支撑。

3 讨论与结论

目前，在半滑舌鳎养殖生产上，腹水病已经变成一种常见疾病。该病能够引起各个养殖期的半滑舌鳎疾病，在苗种阶段尤为厉害，呈现持续性死亡的状态，累计死亡率可超过50%。因而在工厂化养殖过程中，应提高对该病的重视，及时做好疾病的预防及治疗，避免产生不必要的经济损失。

开展大菱鲆弧菌PCR 检测技术的研究，可以有效提高病原检测速度，缩短检验时间，为疾病的早发现早治疗提供技术支撑。根据NCBI 提供的大菱鲆弧菌luxr 基因序列，设计筛选出特异引物luxr130，其具有扩增片段短、扩增效率高、特异性强等特点，能够满足PCR 检测的要求。本项目组从病原库中选择3 株不同来源的大菱鲆弧菌，以及其他常见海水养殖过程中出现的病原菌，共8 株，提取DNA 为模板，在130 bp 的位置能扩增出预期条带，说明设计的引物通用性较好。通过PCR 反应体系和反应条件的优化，建立了大菱鲆弧菌PCR 检测方法。灵敏度测试结果显示，该方法的灵敏度为103CFU/mL，与其他资料中显示的方法灵敏度基本相同[5]。

利用PCR 检测方法与实验室现有病原菌检测方法（16S rDNA 检测方法）分别对实验室样品进行检测，发现两种方法的检测结果完全一致，说明该方法的准确性高。综上可知，本研究建立的大菱鲆弧菌PCR 检测方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确的特点[6]，在养殖生产中应用大菱鲆弧菌PCR检测方法，能够有效缩短检测时间，提高病原检测效率，为疾病的早发现早治疗提供技术支撑。