陆地棉miR156 基因家族生物信息学分析及靶基因预测

王燕美

（1.深圳市光明区科技创新服务中心，广东深圳 518000；2.中国科学院深圳先进技术研究院，广东深圳 518000）

近年来，对植物miRNA 的功能研究发现，miRNA作为基因表达的负调控因子，在植物生长发育、信号转导等各方面都发挥着重要作用[1]。陆地棉因其产量高、适应性广而成为世界上最主要的棉花栽培种，目前针对陆地棉miR156 基因家族尚未进行系统鉴定和分析。本研究对陆地棉miR156 基因家族17 个成员进行了染色体定位、前体序列二级结构预测、成熟序列保守性分析、靶基因预测及表达模式分析，为揭示miR156 在陆地棉生长发育中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

在Plant miRNA Encyclopedia 数据库中下载陆地棉（Gossypium hirsutumL.）miR156 家族成员的前体和成熟序列及陆地棉7 个组织的转录组数据。

1.2 方法

用陆地棉miR156（Gh-miR156）家族成员的前体序列在Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）中BLAST陆地棉基因组序列进行染色体定位。用WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/）网站分析Gh-miR156 成熟序列的保守情况。

用The UNAFold Web Server（http://www.unafold.org/）网站中的RNA Folding Form在线分析Gh-miR156家族成员前体序列的二级结构，参数选择为系统默认值。用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）网站在线预测Gh-miR156 家族成员的靶基因，默认系统参数值，设定罚分1 及以下的基因作为靶基因，罚分越低代表预测的靶基因可信度越高。用EXCEL 2010 软件将转录组中Gh-miR156 家族成员的RPM（Reads Per Million reads）值取对数后做图，筛选出显著性差异表达的miRNA。

2 结果与分析

2.1 Gh-miR156 家族序列分析及染色体分布

Gh-miR156 家族由17 个基因组成，长度为20 ～21 bp（见表1）。成熟序列比对表明，17 个成员的序列一致性很高，仅在5’端第1 个、第15 个和第22个核苷酸处存在差异（见图1）。

图1 Gh-miR156 成熟序列一致性分析

表1 陆地棉miR156 基因家族的成熟序列及其染色体定位

染色体定位分析发现，Gh-miR156 家族成员集中分布在A 亚组和D 亚组的4、5、6、7、13 号这5 条染色体上，其中Gh-miR156a 和Gh-miR156n，Gh-miR156f 和Gh-miR156g，Gh-miR156h 和Gh-miR156i 分别在A 亚组7 号、D 亚组13 号、A 亚组13 号染色体上成簇存在（见表1）。

2.2 Gh-miR156 前体序列的二级结构预测

Gh-miR156 家族17 个成员的前体序列长度不完全一致，长度为82 ～210 bp。二级结构预测结果表明，17 个Gh-miR156 成员都能形成稳定的茎环结构，除Gh-miR156p 成熟的miRNA 序列位于均3’端外，其他成员成熟的miRNA 序列均位于5’端。详见图2。

图2 Gh-miR156 家族成员前体序列的二级结构

2.3 Gh-miR156 的靶基因预测

靶基因预测发现，17 个Gh-miR156 家族成员共有107 个靶基因，主要为SQUAMOSA 启动子结合蛋白样转录因子家族成员，即SPL 转录因子，且均由一个以上的Gh-miR156 家族成员靶向调控。说明Gh-miR156 家族调控靶基因SPL 的作用网络是十分复杂的，暗示在陆地棉中Gh-miR156 通过调控此类靶基因参与发育调控。

2.4 Gh-miR156 的表达模式分析

表达模式分析表明，Gh-miR156 家族成员在陆地棉7 个组织中存在差异表达（见图3）。Gh-miR156m、Gh-miR156o、Gh-miR156p、Gh-miR156q 在茎端中不表达，但在胚、纤维、叶和根中却显著高表达。Gh-miR156q 在纤维的表达量显著高于其他成员，但在花药的表达量显著低于其他成员。以上结果表明Gh-miR156 家族成员通过动态表达参与陆地棉不同组织的生长发育过程。

图3 Gh-miR156 家族成员的表达模式

3 讨论与结论

目前，大量的研究表明miR156 在植物中作为一种正向调控因子，靶向SPL 转录因子，调控芽的分化、营养生长到生殖生长的转换等过程。QIU 等[2]运用生物信息学方法在陆地棉中首次预测到Gh-miR156的靶基因是SPL 转录因子。直至2012 年，WANG 等[3]使用Solexa 高通量测序首次在基因组水平上鉴定到Gh-miR156，并证实了Gh-miR156 的一个靶基因是SPL9 转录因子，且在陆地棉早期阶段抑制纤维发育。XUE 等[4]在伸长期的棉纤维中发现，Gh-miR156 通过介导其靶基因SPL9 mRNA 的剪切，负调控花青素合成相关基因的转录，从而导致纤维细胞中花青素的合成降低，促进过氧化氢的迸发，使纤维细胞终止伸长、转入次生壁合成增厚期的发育。有趣的是，LIU 等[5]在海岛棉中发现，抑制miR156 的功能将导致成熟纤维的长度缩短，表明miR156 可以促进纤维伸长。

本研究对陆地棉中17 个Gh-miR156 家族成员进行了生物信息学分析，并预测了靶基因，为后续通过实验方法验证Gh-miR156 家族成员在陆地棉生长发育中的调控功能提供了理论基础。