猪心传导系统的定位及形态学特点*

李慧慧 陈燕娥 李青蔓 康海艺 朱思明 陈起运 张海英，2，3# 刘 辉，2，3△

（1 海南省热带脑科学研究与转化重点实验室；海南医学院，2 人体解剖学教研室，3 科学实验中心，4 第一附属医院，5 第二附属医院，海口 570100）

心肌由工作心肌和心传导系统（cardiac conduction system，CCS）组成。心传导系统由特殊的心肌细胞构成，主要是发生冲动并传导到心各部分，使心房肌和心室肌均按照一定的节律收缩[1]。心传导系统包括窦房结（sinoatrial node，SAN），房室结（atrioventricular node，AVN），房室束，左、右束支（left bundle branch，LBB；right bundle branch，RBB）和浦肯野纤维（PF）等，窦房结和房室结分别是起搏点和传导缓慢的心肌区域；房室束，左、右束支和浦肯野纤维是快传导心肌细胞[2]。目前国内、外关于猪心传导系统细胞的形态学研究还较少，而心传导系统疾病是心律失常和致心源性猝死的原因之一，但因心传导系统体积小，肉眼不易辨认，较难准确取材，而且关于猪的心传导系统的定位和形态结构的文献也很少，对猪的快传导系统研究极少。为了更好地了解心传导系统细胞的定位和形态学特点，本实验通过Masson 染色观察猪心传导系统细胞，再用结蛋白（desmin）做免疫荧光实验进一步验证传导系统细胞。结蛋白是一种肌细胞特异性中间丝蛋白，是细胞骨架的重要结构[3]，它已经被Orlandi 等[4]证明可以在人的心传导系统中表达，本研究将它作为心传导系统的生物标记物，从细胞水平上为探讨心脏疾病的病理生理学机制提供形态学基础。

1 材料和方法

1.1 标本制备

将猪处死后，取出新鲜的心置于冰上保存，并尽快送往实验室。确定上腔静脉（superior vena cava，SVC）和右心耳（right atrial appendage，RAA）的位置，SVC 的根部和RAA 交汇处是窦房结（图1A），在此区域取1 cm×2 cm 大小的组织块，再将此组织块沿长轴切成约1.5 mm 厚的6～7个组织块，并分别标记。沿SVC 方向切开右心房，沿冠状窦口（coronary sinus ostium，CSO）内缘、三尖瓣（tricuspid valve，TV）附着缘和Todaro 腱之间有一个三角形区域，此区域为Koch 三角，沿着冠状窦口向上大约1 cm 处为房室结区；Koch 三角上方可见一片最薄且透亮的区域，此区域内有房室束通过（图1B），用局部解剖学的方法切下房室结、房室束及左束支，右束支一般会从隔缘肉柱（moderator band，MB）穿过，取一段MB；浦肯野纤维经过心尖部，所以取一块心尖组织。最后把这些组织块修成多个1 cm×1 cm 的组织块放到包埋框里并标记好，置于4%多聚甲醛中固定48 h 以备做石蜡切片。

图1 猪心窦房结、房室结、房室束和左、右束支大致解剖学位置。A：上腔静脉根部和右心耳交汇处：SAN（黑色方框内区域）：窦房结；SVC：上腔静脉；RAAC：右心耳嵴；B：Koch 三角上方区域：AVN（红色椭圆形区域）：房室结；LBB：左束支；RBB：右束支；CSO：冠状窦口；TV：三尖瓣：MB：隔缘肉柱.

1.2 试剂

Masson 染色试剂盒（Abcam，ab150686）；驴血清作为封闭液（索来宝科技有限公司，北京）；一抗：结蛋白鼠抗人抗体（1∶100，Abcam，ab6322）；二抗：Alexa 594（驴抗小鼠594）（1∶200，Abcam，ab150108）。用倒置荧光显微镜（TCS SP5 Ⅱ，Leica）观察并拍照。

1.3 石蜡切片

将切下的所有组织块修剪到合适的大小，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，自来水冲掉固定液后经梯度乙醇常规脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后作连续切片（片厚5 μm）。先切3 张，取第1 张切片做Masson 染色，等确认是心传导系细胞时，取第2 张切片做免疫荧光实验，之后也会切20 张连续切片保存。对连续切片作Masson 染色和免疫荧光实验后在显微镜下观察拍照。

1.4 Masson 染色

石蜡切片烤片3 h，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡复水后置于蒸馏水中静置15 min。Bouin 固定液放入60℃水浴锅中预热10 min，切片放入预热好的Bouin 固定液中固定1 h。取出切片，晾干，用蒸馏水冲洗。取铁木素A 液和B 液等体积混合后配置成铁苏木精工作染液，对切片染色5 min，蒸馏水冲洗。酸性品红染色30 s 后蒸馏水冲洗，磷钼酸溶液分化直到组织胶原纤维在镜下不再呈现红色时就弃去磷钼酸溶液，加入苯胺蓝溶液，随后分别用自来水和蒸馏水冲洗。将醋酸溶液（1%）滴在载玻片上3 min 后弃去冰醋酸溶液，依次用95%乙醇溶液、无水乙醇脱水、二甲苯透明，在组织切片上滴加中性树脂封片，最后用光镜观察拍照。

1.5 免疫荧光显色

石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡复水后，放入盛满柠檬酸盐修复液的大烧杯中，并放在微波炉上做热修复（95℃）16 min，1×PBST（0.01 mol/L的磷酸缓冲盐溶液+5%的Tween 20）冲洗。用10%的驴血清封闭1 h，1 h 后弃去驴血清，加入结蛋白鼠抗体（1∶100），将切片置于湿盒里放在4℃冰箱过夜。第2 天弃去一抗，用PBST 漂洗后加入驴抗鼠Alex 594（1∶200）二抗，在湿盒内室温孵育90 min。弃去二抗，用PBST 漂洗，漂洗后加入抗荧光衰减封片剂，用倒置荧光显微镜观察拍照。为比较窦房结、房室结、左束支和心肌的荧光强度，同一批次做免疫荧光实验，切片在同一曝光度下（204.8 ms）拍照，每张照片随机选择10 个区域用以统计学分析。

1.6 统计学处理

用Image J 测量平均荧光强度，用SPSS 26.0软件和GraphPad Prism 软件来分析作图。用方差分析（单因素）比较窦房结、房室结、左束支与心房肌之间的平均荧光强度，方差不齐时采用Welch’s ANOVA 比较。以P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 窦房结的位置和形态

猪心的窦房结大致位于右心耳嵴和上腔静脉根部的交界处，在光镜下可以观察到窦房结细胞被结缔组织包裹且被窦房结动脉（sinoatrial node artery，SNA）穿过，它与心外膜之间有一薄层脂肪组织相隔，其间尚有一般心肌组织。猪心的窦房结细胞比周围的工作心肌细胞小而致密，呈不规则的椭圆形，排列杂乱、成团分布且与工作心肌细胞没有明确的界限（图2A、图2B）。倒置荧光显微镜显示与普通心肌细胞（cardiac myocytes，CM）相比，窦房结细胞只表达了少部分的结蛋白（图2C、图2D）。

图2 猪心窦房结定位及验证。A，B：Masson 染色；A：×4，标尺=1 mm；B：×10，标尺=100 μm（红色为心肌细胞，蓝色是纤维结缔组织）；C，D：免疫荧光染色，×10，标尺=100 μm。CM：普通心肌细胞；SAN：窦房结；SNA：窦房结动脉.

2.2 房室结的位置和形态

房室结位于Koch 三角区内，紧靠中心纤维体（central fibrous body，CFB）。Masson 染色观察到房室结细胞与普通心肌细胞旁边有明显的转换区细胞（transition cells，TRC），AVN 位于心房与CFB 之间，可见脂肪组织以及房室结动脉（artrioventricular node artery，AVNA）穿行其中，房室结细胞呈圆形或椭圆形且被致密的纤维结缔组织包饶，这些结缔组织杂乱排列，将结细胞分隔成许多大小不等的细胞团。结细胞排列无序，细胞间界限不清且比普通心肌细胞小（图3A、图3B）。倒置荧光显微镜显示与普通的心肌组织相比，房室结细胞只表达了少量结蛋白（图3C、图3D）。

2.3 房室束的位置及形态学特点

房室束又称希氏束（HIS 束），在正常心中，它提供心房和心室肌之间的连接，负责将电脉冲从心房传输到心室且与浦肯野细胞相连。用局部解剖学的方法分区找到房室束，它分为中心纤维体部、未分叉部和分叉部等3 段，在光镜下显示房室束细胞外周有大量的纤维结缔组织，与邻近的普通心肌细胞分界较清，排列杂乱且比普通工作心肌细胞大，呈细长条状（图4A、图4B）。倒置荧光显微镜显示房室束细胞不仅被结蛋白抗体大量标记，而且比周围普通心肌细胞表达更强（图4C）。

图4 猪心房室束定位及验证。A，B：Masson 染色；A：×4，标尺=1 mm；B：×10，标尺=100 μm（红色为心肌细胞，蓝色是纤维结缔组织）；C：免疫荧光染色，×10，标尺=100 μm。HIS：希氏束.

2.4 左、右束支的位置及形态学特点

左束支是由房室束向左的延伸，起始段的细胞形态与房室束一致，左束支末段会延伸至浦肯野细胞网。左束支位于左心室心内膜下，肌纤维粗大、核周围有空晕、细胞淡染，细胞呈2～3 行规律排列在心内膜下（图5A、图5B）；右束支在房室束分支部分的末端以一条细长而独特的束到达右乳头肌的底部[7]，它走行于室间隔右侧心内膜下，延伸至室间隔乳头肌基部，越过右心室腔到达前乳头肌基部[8]。右束支一般从右心室内的隔缘肉柱中通过，光镜下细胞深染、不规则分布，并且比工作心肌细胞大，它被纤维结缔组织包绕，很容易与普通工作心肌细胞辨别（图6A、图6B）。荧光显微镜显示左、右束支细胞表达大量的结蛋白，而且比周围的普通心肌细胞表达更强（图5C、图6C）。

图5 猪心左束支定位及验证。A，B：Masson 染色；A：×4，标尺=1 mm；B：×10，标尺=100 μm（红色为心肌细胞，蓝色是纤维结缔组织）；C：免疫荧光染色，×10，标尺=100 μm。LBB：左束支.

图6 猪心右束支定位及验证。A，B：Masson 染色；A：×4，标尺=1 mm；B：×10，标尺=100 μm；C：免疫荧光染色，×10，标尺=100 μm。RBB：右束支.

2.5 浦肯野细胞的位置及形态学特点

左、右束支向心室延伸形成浦肯野纤维网，浦肯野细胞又称束细胞，一般在心尖部的心内膜下走行。光镜下显示浦肯野细胞比普通心肌细胞大得多，它的细胞核也比心肌细胞核大，染色质浓缩较少、淡染，细胞呈单行柱状排列于心内膜下，肌原纤维似乎以无序方式位于细胞周围[9]（图7A、图7B）。荧光显微镜显示浦肯野细胞被结蛋白抗体标记，且比普通心肌细胞表达更强（图7C）。

图7 猪心浦肯野定位及验证。A，B：Masson 染色；A：×4，标尺=1 mm；B：×10，标尺=100 μm（红色为心肌细胞，蓝色是纤维结缔组织）；C：免疫荧光染色，×10，标尺=100 μm。PF：浦肯野纤维.

2.6 猪心传导系统细胞中结蛋白的表达

免疫荧光染色实验显示在窦房结和房室结细胞中只表达少量结蛋白，而在快传导细胞中结蛋白大量表达，并且荧光强度显著高于普通心肌细胞（图8）。随后用半定量的方法作统计学分析，将SAN周围的右心房心肌命名为CM。比较了SAN、AVN、LBB与心房肌之间结蛋白的平均荧光强度，用Welch’s ANOVA检验，结果显示4者之间的差异有统计学意义（P＜0.05），表示结蛋白在传导系细胞中的表达与普通心肌细胞之间均有差异，且表达量为：LBB＞心房肌细胞＞SAN＞AVN（图8）。

图8 结蛋白在快传导系统与SAN、AVN、CM 之间的平均荧光强度的分析

3 讨论

据报道，世界首例转基因猪心的移植手术于2022 年1 月7 日进行，患者存活2 个月后去世，这是一场历史性的突破，也证实了猪心的研究具有极大的前景。目前对猪心传导系统细胞的形态学研究还不是很全面，本研究用Masson 染色定位心传导系统细胞，最后用结蛋白验证了猪心传导系统。

虽然各种动物之间窦房结位置和形态略有差异[10-12]，但基本可以定位窦房结在上腔静脉根部和右心耳嵴的交界处。光镜下，窦房结呈不规则椭圆形且有结动脉穿过，它与心外膜之间有一转换区；房室结属于慢传导细胞，在很多动物中位置比较恒定[13-14]，约90%是位于冠状窦口、三尖瓣附着缘和Todaro 腱构成的Koch 三角内。光镜下房室结细胞呈不规则椭圆形且被致密的纤维结缔组织包绕；房室束位于Koch 三角上方最薄的部位，它向下延续分成左、右束支，最后在心尖部汇集成浦肯野纤维网，用于心室的快速同步激活[11]；左、右束支沿室间隔左侧延伸，在室间隔大约上1/3 处，通常分为前、后2 支或前、中、后3 支，分布于前、中、后乳头肌根部和室间隔，后分散成浦肯野纤维[12]；右束支在希氏束分支部分的末端以一条细长而独特的束到达右乳头肌的底部[13]，它走行于室间隔右侧心内膜下，延伸至室间隔乳头肌基部，越过右心室腔到达前乳头肌基部[14]。光镜下观察到快传导细胞比普通心肌细胞大且周围有结缔组织包围。前人的研究表明结蛋白在心快传导系统细胞的表达高于普通心肌细胞[15-16]，在荧光显微镜下可见结蛋白在窦房结及房室结中的表达均弱于普通心肌细胞，快传导系统细胞中结蛋白表达均高于普通心肌细胞。另外，结蛋白突变会导致多种疾病，包括传导阻滞和心源性猝死等[4，17-20]，这也从侧面说明了结蛋白在房室束、左、右束支、浦肯野细胞中的高表达可能是引起心传导系统疾病的生理基础。

本实验进行了猪心的心传导系统的形态学研究，并且进一步证明了结蛋白在心传导系统中的差异性分布，为研究心脏疾病提供了相关的形态学基础。