婆罗双树样基因4在膀胱尿路上皮癌的表达及其与临床病理特征的关系*

范大铬 周奇芬 邹秋琴 王亦曾 庄小玲 俞曦洁 王声耀 林 娜 吴春林 张文敏

（福建医科大学，1 附属第二医院病理科，泉州 362000；2 基础医学院病理学系，福州 350001）

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统第2 常见的恶性肿瘤，全球男性发病率位居第4 位。膀胱癌好发于中老年男性，在过去40 年发病率逐渐增高[1-2]。但膀胱尿路上皮癌确切的分子机制仍未明确，尚无有效的靶向治疗药物。婆罗双树样基因4（spalt-like peotein gene 4，SALL4）是2002 年 由AI-Baradie等[3]在研究杜安-桡侧列综合征（Duane-radial ray syndrome，DRRS）家系遗传时发现的新基因，是果蝇婆罗双树基因spalt 的同源异型基因SALL 家族中的一员，位于染色体20q13.13-q13.2。SALL4 在分化成熟的组织中不表达，但在肿瘤组织中重新表达[4-5]，与维持胚胎干细胞特性、肿瘤侵袭和转移以及表观遗传修饰相关[6]。目前，尚无SALL4 在膀胱尿路上皮癌中的相关研究。本研究旨在探讨SALL4 在膀胱尿路上皮癌的表达情况及与临床病理特征的关系，以期为研究膀胱癌侵袭转移机制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料收集

选取福建医科大学附属第二医院2012 年1 月～2019 年6 月间170 例膀胱尿路上皮癌手术切除标本。所有患者均以血尿就诊，术前均未行放射治疗及化学药物治疗。所有病例均经病理诊断证实，病理分级按WHO 分级标准，其中高级别尿路上皮癌120 例，低级别尿路上皮癌50 例；肌层浸润性尿路上皮癌48 例，非肌层浸润性122 例；男性132 例，女性38 例；年龄23～90 岁（平均年龄65.5 岁）。肿物最大径0.4～10.0 cm（平均最大径3.7 cm），膀胱各个部位均可发生，前壁、后壁、侧壁、三角区及顶部分别为7、52、77、19 及2 例，13 例见多灶性病变。随访时间最长92 个月，平均随访时间46.5 月。另取癌旁正常膀胱黏膜20 例。以电话或浏览我院电子病理系统及电子病历系统进行随访，随访截止时间至2019 年11 月1 日。本研究经医院医学伦理审查委员会审查通过。

1.2 组织芯片制作

手术标本经3.7% 中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋。采用韩国UNITMA 公司生产的手动组织微阵列仪Quick-Ray（UATM-272）制成3 mm孔径的组织芯片。具体步骤为：①取出石蜡及切片，镜下观察，选取打孔位置；②以组织芯片仪3 mm 取样针分别在石蜡上取出阳性对照及阴性对照组织放入蜂蜡中，做好标记，再取出膀胱癌肿瘤石蜡上组织，放于蜂蜡中，每个病例取2 个孔，并做好标记；③蜂蜡填满石蜡组织后使其表面压平，压平面朝下放于包埋盒中，并把包埋盒放入60℃恒温箱中使其融化；④待其完全融化后，于包埋盒中加入干净液态石蜡，然后置于冰上使其凝固，并取下包埋盒。切片后进行免疫组织化学显色。

1.3 H-E 染色及免疫组织化学检测

以5 μm 厚连续切片数张，置于防脱载玻片上，60℃烤片机上烘烤60 min 脱蜡，行H-E 染色及免疫组织化学检测。后者采用EnVision 二步法，即经0.01 mol/L 枸橼酸缓冲液抗原修复和封闭后，加入兔抗人SALL4 多克隆抗体，室温孵育4 h 后，加入相应二抗，室温孵育1 h，DAB 染色，显微镜下观察。一抗SALL4 及二抗均购自福州迈新公司。

1.4 免疫组织化学结果判定

SALL4 以胞核出现棕黄色颗粒为阳性着色，于显微镜下400 倍视野随机选取5 个有代表性的不同区域，每个视野的得分由阳性细胞比例和着色强度两方面决定。按照阳性细胞比例：无着色、≤5%、6%～25%、26%～50%、＞50%分别得0、1、2、3、4 分；按照着色强度：无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别得0、1、2、3 分。将2 项得分相乘，选取的5 个视野得分的平均值为最终得分。0～1 分判定为阴性，≥2 分判定为阳性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 23.0 统计软件对数据进行处理。膀胱尿路上皮癌SALL4 表达与临床病理参数的组间差异采用χ2检验进行统计分析；用Kaplane-Meier方法评估单变量生存率分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SALL4 蛋白在膀胱尿路上皮癌的表达

正常膀胱尿路上皮未见SALL4 表达（0/20）（图1A），膀胱癌SALL4 蛋白的表达率为37.60%（64/170）。在膀胱低级别尿路上皮癌中仅见个别病例散在个别细胞弱阳性（图1B），阳性率为10.00%（5/50）。在膀胱高级别尿路上皮癌中SALL4 表达率明显增加，阳性率达49.12%（59/120）（图1C），细胞表达量及阳性强度均明显增加（P＜0.001）。此外，淋巴结转移灶也有SALL4 蛋白表达（图1D）。

图1 SALL4 蛋白在正常膀胱尿路上皮（A）、低级别尿路上皮癌（B）、高级别尿路上皮癌（C）和淋巴结转移灶（D）中的表达，免疫组织化学染色，标尺=100 μm

2.2 SALL4 蛋白在膀胱尿路上皮癌的表达水平与临床病理特征的关系

分析SALL4 蛋白的表达水平与膀胱尿路上皮癌临床病理特征的关系，发现随着组织学分级的增加，SALL4 蛋白表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.001），同时，SALL4 表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及脉管侵犯呈正相关性（P＜0.05）（表1），而与患者年龄、肿物大小无相关。

表1 SALL4 表达与膀胱尿路上皮癌临床病理特征的相关性[n（%）]

2.3 SALL4 蛋白表达与膀胱尿路上皮癌复发和预后的关系

对收集的膀胱癌患者随访近8 年，170 例膀胱癌患者复发24 例，复发率达到14%，复发患者中SALL4 蛋白过表达12 例，未复发患者SALL4蛋白表达阴性12 例，两者比较差异无统计学意义（P=0.178）。分析SALL4 蛋白表达水平与患者预后的关系，累积生存曲线显示，SALL4 蛋白阳性表达组总生存时间较SALL4 阴性组短（图2），预后差，差异有统计学意义（r=3.972，P=0.024）。

图2 SALL4 蛋白表达与膀胱尿路上皮癌患者生存时间的相关性

3 讨论

膀胱尿路上皮癌依组织学和分子特征分为低级别和高级别尿路上皮癌，以及非肌层和肌层浸润性尿路上皮癌。膀胱低级别尿路上皮癌多为非浸润性，少数为非肌层浸润，罕见肌层浸润；膀胱高级别尿路上皮癌常浸润黏膜固有层、肌层或更深层浸润，具高复发率和高进展率。膀胱尿路上皮癌的预后与组织学分级、分期、脉管浸润及淋巴结转移相关[7]。膀胱低级别尿路上皮癌罕见脉管侵犯及淋巴结转移，预后较好，5 年生存率超过90%[8]；膀胱高级别尿路上皮癌较易见脉管侵犯及淋巴结转移，预后较差，5 年生存率低于50%[9-10]。

膀胱尿路上皮癌的发病机制较复杂，尚未完全明确，膀胱低级别尿路上皮癌大部分为FGFR3基因突变[8]；而膀胱高级别尿路上皮癌多为TP53、PTEN 及RB1 基因突变，10%～20%存在FGFR3 突变[11-13]。文献报道，SALL4 蛋白在多种肿瘤中过表达，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和转移，并与淋巴结转移、肿瘤分期和不良预后呈正相关[14-15]。本研究结果显示，SALL4 蛋白在正常膀胱尿路上皮不表达，在膀胱低级别尿路上皮癌仅个别病例散在细胞弱阳性，而在膀胱高级别尿路上皮癌中表达明显增多、增强；统计分析结果显示SALL4 蛋白表达与膀胱尿路上皮癌组织学分级、浸润深度、淋巴结转移、脉管侵犯呈正相关；生存分析显示，SALL4 蛋白表达阳性组预后较差，总生存时间更短，与文献报道结果相一致[5]。

既往研究显示，SALL4 蛋白可在不同类型的肿瘤中表达，在子宫内膜癌中有47.7% SALL4 蛋白表达，而在子宫内膜增殖症及正常子宫内膜中不表达[16]；在肝细胞癌的研究结果显示，癌旁肝组织仅见弱阳性表达（2/44），而在肝细胞癌组织中见较多阳性表达（58/126）[17]。与之相似，SALL4蛋白在正常膀胱尿路上皮不表达，而在低级别尿路上皮癌仅个别病例散在阳性，高级别尿路上皮癌表达则明显增加。此外，原发性肺腺癌、肺鳞状细胞癌中SALL4 蛋白过表达分别与肿瘤分化及肿瘤分期呈正相关[18]；SALL4 蛋白高表达与肝癌高临床分期等呈正相关[17]；在胃癌的研究中也发现，黏膜下癌比黏膜内癌更易见SALL4 甲基化，致浸润性增强[19]。另有研究显示，在胃癌中SALL4 蛋白过表达与淋巴结转移正相关[20]。本研究在膀胱尿路上皮癌的研究中也表明，SALL4 蛋白的表达与浸润深度及淋巴结转移呈正相关。此外，有学者研究显示，过表达SALL4 蛋白的子宫内膜癌预后更差[16]，SALL4 蛋白过表达的胃癌与预后差呈正相关[20]。膀胱尿路上皮癌的预后与脉管侵犯相关[7]。本研究与既往学者研究结果一致，SALL4 蛋白过表达组生存时间短于SALL4 蛋白表达阴性组，同时，SALL4 蛋白过表达与脉管侵犯有相关性，进一步提示SALL4 蛋白过表达组预后更差。

综上所述，本研究初步分析了SALL4 蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达情况及与临床病理特征的关系，其表达主要见于高级别尿路上皮癌，并且与肌层浸润性、淋巴结转移等正相关，高表达SALL4 蛋白对于判断膀胱癌预后有一定意义，但是SALL4 基因参与膀胱尿路上皮癌进展及迁移、侵袭的分子机制还需更进一步的探讨。