姜黄素对大鼠睾丸缺血再灌注损伤后的保护作用及核因子E2相关因子2表达的影响*

朱 薇 张建华# 孟繁亮 章学文 王 俊 陈思思 张金萍

（1 湖州市第三人民医院，湖州 313000；2 绍兴文理学院医学院临床医学系，绍兴 312000）

睾丸扭转多发生于青春前期和青春期男性，是导致男性不育的常见原因之一，常需急诊手术进行复位，即使早期手术复位成功，患者仍会出现精子总量减少、畸形率增高等异常现象[1-2]。近年来，研究证实睾丸扭转复位的损伤主要是缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，I/R）[3]。核因子E2 相关因子2（nuclear factor-erythriod 2-related factor 2，Nrf2）是调控细胞对抗氧化应激损伤的关键转录因子，其介导Nrf2/ARE 通路为重要的内源性抗氧化应激通路之一[4]。已有实验证明姜黄素对脑、心脏等的缺血再灌注损伤均有保护作用[5，6]，但对睾丸缺血再灌注损伤后睾丸组织Nrf2 的表达有无影响尚未见报道。本研究从姜黄素对睾丸缺血再灌注损伤后生精保护作用，探讨其对Nrf2 表达调控的作用机制，为临床治疗睾丸扭转复位后生精功能低下提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取SPF 级4 周龄雄性SD 大鼠32 只，体质量90～100 g，清洁级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（合格证编号：20170005056712）。正式进入实验前适应性饲养7 d，动物房室内温度为21℃～25℃。相对湿度为50%～65%，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。给予标准饲料，自由进食水，周围环境安静。

1.2 主要药品、试剂

姜黄素（Sigma-Aldrich 上海贸易有限公司提供，批号：C1386-5G）；舒泰50（批号：BN7VU4）；RNAStore 样本保存液（天根，DP408-02）；RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN，批 号：74134/50rxn/）；FastKing RT Kit（With gDNase）（天根，KR116-02）；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根，FP205-02）。

1.3 动物模型建立与分组

SD 健康雄性大鼠32 只随机分为假手术组、生理盐水组、姜黄素单次给药组、姜黄素连续给药组，每组8 只。所有动物模型按组分笼饲养。所有实验动物均术前12 h 禁食，术前4 h 禁水。睾丸扭转模型采用Turner 法[7]建立。假手术组：应用舒泰50（50 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后将左侧阴囊切开，游离左侧睾丸后缝合阴囊切口。生理盐水组：应用舒泰50（50 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后将左侧阴囊切开，游离左侧睾丸后，绕精索顺时针扭转睾丸720°后，用1 号丝线固定睾丸，缝合阴囊，关闭切口。2 h 后，第2 次切开左侧阴囊，将扭转的睾丸复位固定，可见睾丸组织由暗红色逐渐恢复红润。于复位前30 min，灌胃法灌注生理盐水（200 mg/kg）。姜黄素单次给药组：步骤同生理盐水组，于复位前30 min，灌胃法灌注姜黄素悬液（200 mg/kg，采用0.5%羟甲基纤维素钠溶解成悬浊液）。姜黄素连续给药组：步骤同生理盐水组，于复位前30 min，灌胃法灌注姜黄素悬液（200 mg/kg），术后每天同等药物灌胃1 次，连续7 d。

1.4 睾丸超声观察

术后1 周行左侧睾丸超声观察。采用GE Voluson E8 彩色多普勒超声诊断仪，使用11L-D 线阵变频探头，选用小器官睾丸模式，采用灰阶频率15.0～22.0 MHz。观察各组睾丸形态、大小、回声、内部结构等。

1.5 精子活动率和精子计数的测定

各组大鼠于术后6 周处死，取左侧附睾，剥除附睾附着组织，生理盐水冲净后拭干。取部分附睾，放入恒温水浴箱盛有生理盐水的试管中，眼科剪适当剪碎，37℃恒温孵育30 min，待附睾精子充分游离后，显微镜下记录精子活动率（200 个精子活动情况）。此外按特定部位切取附睾，精密电子天平称重，迅速放入EP 管中，参照范莉英等[8]的方法加入1 mL 冷生理盐水，眼科剪充分剪碎，过滤后以4 000 r/min 离心5 min。离心期间配置精子固定液（碳酸氢钠5g、4%甲醛1 mL，加蒸馏水配置到100 mL 总量）。取1 mL 精子固定液到每管滤液沉淀物中混匀，固定10 min 后，滴入细胞计数板，静置3 min 后按常规方法计数。同时计算精子相对计数值（106个/100 mg 附睾重）。精子相对计数=附睾精子数/附睾重量×100%。

1.6 睾丸病理学观察

各组大鼠于术后6周处死，切取各组左侧睾丸组织，迅速放入4%多聚甲醛充分固定24 h以上，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋。沿睾丸组织作连续切片，切片厚度4 μm。H-E染色后在光镜下观察睾丸组织病理改变情况。

1.7 Nrf2 mRNA 表达量测定

将各组大鼠处死后，取各组左侧适量睾丸组织，迅速放入RNAStore 样本保存液中备用。取适量组织采用RNeasy Plus Mini Kit 试剂盒提取总RNA，用NanoDrop 2000 核酸分析仪测定RNA 浓度和纯度，A260/A280 控制在1.8 至2.0 之间。采用TIANGEN FastKing RT Kit 逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板，利用实时荧光定量PCR 仪进行qPCR，Nrf2[9]上游引物序列为5′-GACAAACATTCAAGCCGATTAGAGG-3′，下游引物序列为5′-ACTTTATTCTTCCCTCTCCTGCG T-3′；内参β-actin[10]上游引物序列为5′-CACGGCAT TGTAACCAACTG-3′，下游引物序列为5′-TCTCA GCTGTGGTGGTGAGG-3′。引物由浙江尚亚生物技术有限公司合成。PCR 反应条件：预变性94℃30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，循环40 次。采用2-ΔΔCt法计算各目的基因mRNA 相对表达水平。

1.8 统计学处理

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way Anova），组间两两比较采用SNK 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 睾丸超声表现

假手术组表现为睾丸形态大小正常，内部回声均匀，包膜光整（图 1A）；生理盐水组表现为睾丸外形缩小，内部回声不均匀，可见多量回声增强区及小片状低回声区，包膜增厚（图 1B）；姜黄素单次给药组表现为睾丸外形略缩小，内部回声不均匀，可见少量回声增强区，睾丸周围见少量无回声区，包膜略增厚（图 1C）；姜黄素连续给药组表现为睾丸形态尚可，内部回声欠均匀，内可见少许强回声，包膜尚光整（图 1D）。

图1 各组睾丸超声表现。A：假手术组；B：生理盐水组；C：姜黄素单次给药组；D：姜黄素连续给药组.

2.2 精子活动率和精子计数的变化

与假手术组比较，生理盐水组精子活动率、精子计数均显著降低（P＜0.05）；与生理盐水组比较，姜黄素连续给药组精子活动率、精子计数均显著升高（P＜0.05）；与姜黄素单次给药组比较，姜黄素连续给药组精子活动率、精子计数均显著升高（P＜0.05）；与姜黄素连续给药组比较，假手术组精子活动率、精子计数均显著升高（P＜0.0 5）（表1）。

表1 各组大鼠精子活动率、精子计数的比较（n=8，±s）

表1 各组大鼠精子活动率、精子计数的比较（n=8，±s）

*P＜0.05 vs 生理盐水组；#P＜0.05 vs 姜黄素单次给药组；▲P＜0.05 vs 姜黄素连续给药组

组别精子活动率（%） 精子计数（×106/100 mg）假手术组68.50±7.50*#▲36.50±2.20*#▲生理盐水组35.38±5.5319.38±2.50姜黄素单次给药组41.38±7.8022.50±3.42*姜黄素连续给药组58.50±6.82*#31.13±2.70*#

2.3 睾丸组织病理形态学变化

假手术组睾丸生精小管结构正常完整，细胞排列规则，生精上皮内可见到发育不同阶段的各级生精细胞，管腔内可见到精子（图 2A）；生理盐水组较假手术组睾丸生精小管管腔体积明显萎缩变小，各级生精细胞排列紊乱，生精细胞脱落，个别发生坏死，层次减少（图 2B）；姜黄素单次给药组较假手术组睾丸生精小管内各级生精细胞欠整齐，排列略显紊乱，可见生精细胞脱落现象，但层次仍可辨认（图2C）；姜黄素连续给药组较假手术组生精小管内有少量生精细胞脱落，排列基本整齐有序，层次清楚（图2D）。

2.4 睾丸组织Nrf2 mRNA 的表达

与假手术组Nrf2 mRNA（1.02±0.03）比较，生理盐水组睾丸组织Nrf2 mRNA（1.31±0.06）表达水平明显升高（P＜0.05）；与生理盐水组Nrf2 mRNA 比较，姜黄素连续给药组睾丸组织Nrf2 mRNA（1.78±0.05）表达水平明显升高（P＜0.05）；与姜黄素单次给药组Nrf2 mRNA（1.39±0.07）比较，姜黄素连续给药组睾丸组织Nrf2 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）；与姜黄素连续给药组睾丸组织Nrf2 mRNA 比较，假手术组睾丸组织Nrf2 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）。

3 讨论

睾丸扭转复位是一个典型的缺血再灌注损伤过程，虽然扭转后睾丸得到复位可以恢复血供，但睾丸在缺血的初期已经发生损害，且在再灌注阶段这种损伤反应会加重。超声检查是睾丸扭转首选的影像学检查方法，不同程度的睾丸缺血损伤在超声下有不同的影像学表现[11]，因此超声可以对睾丸扭转后的缺血程度进行较为客观的评估。氧自由基损伤是缺血再灌注损伤的病理生理基础。扭转后组织中抗氧化酶活性明显降低，此时会产生大量氧自由基，活化黏附在小静脉壁上的白细胞，通过释放中间介质，如溶酶体酶、花生四烯酸代谢产物、反应性氧中间产物等，从而损害微血管系统以及睾丸实质组织，因此清除氧自由基对减轻睾丸的氧化损伤至关重要。超氧化物歧化酶（SOD）是组织中清除体内超氧离子自由基的抗氧化酶之一[12]，睾丸组织缺血、缺氧时该清除系统功能降低或丧失，再灌注后恢复血供，组织内SOD 活性下降。过多的氧自由基引起生物膜不饱和脂质过氧化反应生成丙二醛（MDA），反映组织中自由基含量及脂质过氧化程度[13]。课题组前期研究[14]表明：在睾丸缺血再灌注损伤中，姜黄素通过上调Nrf2 蛋白，提高SOD 活性，清除氧自由基，降低组织内MDA 含量，起到保护睾丸的作用。本研究发现，生理盐水组可见睾丸生精小管缩小和坏死脱落细胞，层次结构紊乱，而姜黄素单次给药组和连续给药组睾丸组织结构损伤明显减轻，连续给药组较单次给药组生精小管结构更加完整，排列更整齐，层次更清楚，表明连续给药效果明显优于单次给药，与超声改变相符。

Nrf2 是细胞调节抗氧化应激反应的关键性转录因子[15]。正常生理状态下，Nrf2 定位于细胞质内，与胞浆蛋白伴侣分子Keap1（Kelch-like ECH associated protein1，Keap1）结合而处于活性抑制状态[4]。当细胞受到氧化应激源产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）或其他理化因子刺激时，Nrf2 蛋白与Keap1 解偶联后发生核转位，在细胞核内与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合形成Nrf2/ARE 信号通路[16]。一方面，氧化应激ROS 造成Keap1-Nrf2 复合体解离，导致游离的Nrf2 增加，Nrf2 从细胞质进入细胞核，并上调下游抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表达，降低氧化应激[17]；另一方面，氧化应激还能加速Nrf2 的mRNA 转录，促进Nrf2 蛋白合成[18]。研究显示，Nrf2/ARE 通路在心、脑、肝等多个脏器中均可发挥内源性抗氧化作用[19]，通过激活ARE，启动受ARE 调控的下游一系列抗氧化因子基因如SOD、HO-1、NQO1 等的转录及表达，增加细胞抗氧化蛋白生成，减轻缺血再灌注损伤[20-21]。

姜黄素是一类从传统中药姜黄根茎中分离出的天然产物，为多酚类化合物，其脂溶性好，性质稳定[22]。姜黄素味苦、辛，性温，归脾、肝经，具有破血行气、通经止痛功能[23]。近年来研究显示姜黄素具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多方面药理作用。本研究结果显示：生理盐水组精子质量明显低于假手术组，而姜黄素单次给药组和连续给药组精子质量较生理盐水组明显升高，且连续给药组精子质量优于单次给药组，说明睾丸I/R 时睾丸内部损伤，导致生精功能明显降低，姜黄素可减轻睾丸的缺血再灌注损伤，改善睾丸I/R 生精功能。I/R后睾丸较正常情况下Nrf2 的表达升高，而此期间睾丸在彩色多普勒超声中表现为外形缩小、回声不均匀，病理形态学损伤重，提示此期间睾丸内对于应激和氧化损伤虽然有保护性反应，上调Nrf2 表达以对抗损伤，但是此作用不足以对抗此期间睾丸缺血再灌注所释放的活性氧簇、炎症因子和细菌性内毒素的致损伤作用，睾丸组织损伤程度仍较重。姜黄素给药组通过进一步增加Nrf2 的表达水平，激活Nrf2/ARE 信号通路，从而诱导下游抗氧化应激基因过表达，增强组织抗氧化应激和清除活性氧自由基的能力，减轻睾丸组织损伤，且连续给药组表达Nrf2 的水平明显优于单次给药组。超声能直观、客观反映睾丸扭转后的大小、形状、内部回声等相关情况，生理盐水组睾丸外形缩小，内部回声不均匀，而姜黄素单次给药组和连续给药组睾丸外形尚可、内部回声较均匀，且连续给药组超声形态优于单次给药组，其与上述改变相符。

综上所述，Nrf2 对大鼠睾丸缺血再灌注损伤后的生殖功能起到了一定的保护作用，而姜黄素可以提高睾丸组织Nrf2 的表达，通过激活Nrf2/ARE 通路，增加下游抗氧化蛋白的表达，提高睾丸清除氧自由基的能力，从而减轻睾丸缺血再灌注损伤，改善精子质量。然而对于姜黄素调控睾丸Nrf2 的表达，从而对睾丸缺血再灌注损伤起到保护作用的具体机制，尚需进一步的探讨研究。