STAT3 抑制剂S3I-201对人肝癌BEL-7402细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

李玲玲 林斯晓 周文英 彭晓谋

肝癌是常见的消化道恶性肿瘤,也是我国第三大肿瘤致死病因[1]。其发病隐匿、进展快、恶性程度高、预后差,严重威胁着人类健康。在治疗上Ⅰ和Ⅱ期患者以手术(肝切除术和肝移植术)为主,对Ⅲb期的晚期患者除了放疗、经导管动脉化学栓塞( transcatheter arterial chemoembolization,TACE)等治疗手段外结合靶向治疗亦可使患者获益[1]。

信号转导和转录激活子3(STAT3)作为细胞内重要的信号转导蛋白,密切参与了多种肿瘤的发生发展,可作为癌症治疗的重要靶点[2]。目前,以 STAT3 为靶点开发抗肿瘤药物的研究越来越多。S3I-201是近年来鉴定出的一个 STAT3小分子抑制剂,能特异结合在STAT3的SH2结构域,从而阻断STAT3的磷酸化/活化、STAT3-STAT3复合物形成及细胞核内STAT3-DNA结合活性,并最终抑制依赖于STAT3的转录活性[3]。S3I-201优先作用于持续性表达STAT3活化蛋白的肿瘤细胞,诱导其生长抑制和凋亡发生[4-6]。本文旨在探讨S3I-201对肝癌细胞BEL-7402的增殖、细胞周期和细胞凋亡等的影响,为肝癌相关的靶向药物研发和治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM、FBS、PBS 购自美国 Gibco公司;BEL-7402保存于中山大学附属第五医院中心实验室;细胞培养皿(板);STAT3 抑制剂( 商品名 S3I-201)购自美国MCE公司;Cell Couting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒及Annexin V-FITC 凋亡试剂盒购自日本Dojindo公司;磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax抗体购自美国Cell Signaling Technology (CST)公司;内参抗体、HRP标记的羊抗兔和羊抗小鼠购自Proteintech公司;EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司;预染蛋白质Marker为Thermofisher产品;蛋白提取RIPA试剂、BCA蛋白定量试剂盒、脱脂奶粉、PVDF膜浸润活化液、细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;预制蛋白电泳凝胶为EZBiolab产品; Western blot 化学发光剂购自上海天能(Tanon)科技有限公司;FITC标记的羊抗鼠荧光二抗、DAPI染色液、抗淬灭封片剂购自武汉博士德生物技术有限公司;Q-PCR引物、RT试剂盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTM购置TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人肝癌细胞BEL-7402 用含10%胎牛血清的DMEM培养液(100 U/mL青霉素,100 μg/mL链霉素),在37 ℃、5% CO2的培养箱内贴壁培养。1～2 d换液,每3～4 d 进行传代,实验时选用对数生长期的细胞,取生长良好的3～6代用于实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 以对数生长期的BEL-7402细胞进行实验,按照不同实验条件处理后进行检测。每孔加入10 μl CCK-8溶液,培养箱中孵育2 h,置于酶标仪中于450 nm下读取OD值,根据公式:细胞存活率%=(加药孔OD-空白OD)/(对照孔OD-空白OD)×100%,计算不同S3I-201浓度的细胞存活率,实验重复3次,绘制细胞增殖曲线,计算IC50值。

1.2.3 EdU细胞增殖检测 取对数生长期的细胞,以每孔1×105细胞接种于12孔板中,培养24 h后,S3I-201处理48 h,之后用20 μM溶液孵育标记6 h,PBS洗涤1～2次,每次5 min,4%多聚甲醛固定30 min,2 mg/mL的甘氨酸孵育5 min中和过量的醛基,PBS洗涤,0.5% TritonX-100通透细胞,1×Apollo和1×Hoechst33342染色、PBS洗涤后,用抗荧光淬灭封片剂封片,于荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4 流式细胞术进行细胞周期和细胞凋亡检测 细胞凋亡检测:药物处理后的细胞经胰酶消化后用1×AnnexinⅤ Binding Solution制备成终浓度为1×106/mL的单细胞悬液,取100 μL该细胞悬液依次加入AnnexinⅤ,FITC结合物及PI Solution,室温下避光孵育15 min,加入400 μL 1×AnnexinⅤBinding Solution,在1h内完成检测。对照细胞设置了未染色组、AnnexinⅤ-FITC染色组及PI染色组,分别用于上机(Beckman Coulter Epics-XL)检测中的电压和补偿调节。细胞周期检测:采用PI染色法。用6孔细胞培养板接种细胞,每孔1.5×106个,细胞处于对数生长期,60%～70%汇合度后更换成含药培养液,分别处理0 h、24 h、48 h后,收集细胞检测;胰酶消化细胞1000 rpm,5 min沉淀细胞后,先用预冷的PBS洗2次,再1000 rpm,5 min沉淀细胞;重悬后的细胞悬液1000 rpm,5 min离心后,用1 mL预冷的70%乙醇轻混匀,4 ℃固定2 h以上,然后1000 g离心5 min沉淀细胞,预冷PBS洗一次,1000 g离心5 min再次沉淀细胞,加RNase A溶液及PI染色后上机检测,应用ModFit LT 5.0软件对细胞周期检测的原始数据进行拟合。

1.2.5 蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测 收集处理后的细胞,RIPA提取总蛋白,BCA法测定总蛋白浓度,取30 μg蛋白样品上样,经SDS-PAGE电泳分离后将其转移至PVDF膜上,洗膜后用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h,磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax及内参抗体均以1∶1000 4 ℃孵育过夜。经TBST洗涤后,加入HRP标记的特异性二抗以1∶10000室温孵育1 h,ECL发光显影。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 S3I-201对BEL-7402细胞增殖的影响

S3I-201对BEL-7402细胞体外增殖的影响分别采用CCK-8和EdU法进行检测,结果分别见图1和图2。经不同浓度的S3I-201作用48 h后,随着药物浓度的增加BEL-7402细胞存活率呈现不同程度的下降,差异有统计学意义(F=16.50,P=0.0001),其中药物浓度为280 μM时即对细胞增殖的抑制作用达显著水平(P<0.05)。IC50=343.9 μM。

图1 S3I-201作用48 h对BEL-7402细胞体外增殖的剂量依赖性抑制作用

图2 S3I-201对BEL-7402细胞增殖的抑制作用(×200)

采用EdU增殖法检测S3I-201对BEL-7402细胞增殖的影响, 结果显示:与对照组相比280 μM的S3I-201能显著抑制BEL-7402细胞的增殖(图2)。

2.2 S3I-201对BEL-7402细胞凋亡的影响

根据CCK-8结果,S3I-201的工作浓度采用230 μM,在此浓度下药物可以发挥作用而又能使细胞保持较高的存活率。流式细胞术检测结果显示(图3),S3I-201作用24 h后,发生早期凋亡(右下象限)的细胞比对照组显著增加(P<0.05),药物作用48 h后,发生早期凋亡的细胞急剧增加(P<0.001),达60.7%;S3I-201诱导BEL-7402细胞发生晚期凋亡的情况与诱导发生早期凋亡类似,即:药物作用24 h后,发生晚期凋亡(右上象限)的细胞比对照组显著增加(P<0.05), 48 h后,发生晚期凋亡的细胞数目急剧增加(P<0.001),达28.5%。

A为流式散点图; B为析因设计的方差分析。图3 S3I-201对BEL-7402细胞凋亡的影响

2.3 S3I-201对BEL-7402细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

用230 μM的S3I-201处理BEL-7402细胞后,提取细胞总蛋白进行Western blotting检测。结果表明,S3I-201能极显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.05),显著上调促凋亡蛋白Bax的表达(P<0.05)(图4)。

2.4 S3I-201对BEL-7402细胞周期的影响

将230 μM的S3I-201分别与BEL-7402细胞共培养24 h及48 h,结果显示与对照组相比,共培养24 h后处于细胞周期不同时相(G0/G1,S,G2/M)的细胞数目没有显著变化(P>0.05);共培养48 h后G0/G1期的细胞数量显著降低(P<0.05),S期细胞数量显著升高(P<0.05),而G2/M的细胞比例没有显著变化(P>0.05)。可见,S3I-201能将BEL-7402阻滞于S期,从而影响其增殖(图5)。

A为拟合的细胞周期图; B为析因设计的方差分析。图5 S3I-201对BEL-7402细胞周期的影响

3 讨论

随着基因组学、蛋白质组学等组学及分子生物学的不断发展,肝癌靶向治疗成为了传统治疗外非常重要的一种治疗手段[7-8]。近年来,除索拉非尼(SOR)外,仑伐替尼、瑞戈非尼及卡博替尼等靶向药物陆续在国内外上市,很大程度上提高了对肝癌的疗效[9-10]。因此,开发新的靶向药物以用于改善晚期肝癌患者的生存质量也是未来研究工作的重要方向之一。

Janus 激酶(Janus kinase,JAK)-STAT 信号通路主要介导由细胞膜向细胞核的信号转导并激发转录过程。其中,STAT3作为STAT家族成员在许多癌症中持续性高表达。持续活化的 STAT3进一步促进癌肿发展以及产生抗癌药物抵抗,STAT3已成为治疗癌症的引人注目的靶点。目前,STAT3 非多肽类小分子抑制剂得到了迅速的发展,其中,基于计算机辅助药物筛选技术得到的化合物S31-201及其衍生物是直接靶向STAT3蛋白的SH2结构域的小分子抑制剂。在本研究中,我们用S31-201对人BEL-7402肝癌细胞进行了量效和时效关系研究,结果表明:药物浓度在0～400 μM区间时,随着药物浓度逐渐加大,对细胞的杀伤作用越显著,最高达80%以上;分别于0 h、12 h、24 h、48 h、60 h等时间点用230 μM的S31-201进行时效关系分析发现,药物作用24 h以前未见对细胞的明显杀伤作用,但随着作用时间的延长细胞存活率明显下降,48 h存活率约80%,60 h时下降到约60%。

阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡是抗癌药物发挥作用的重要方式。本实验中我们的结果显示:S31-201能阻断BEL-7402肝癌细胞S期DNA的复制,发生细胞周期S期阻滞。当前抗肝癌药物引起肝细胞癌发生周期阻滞的诸多研究中,肝癌细胞发生G0/G1、S及G2/M期阻滞均有报道[11-13],但以S期阻滞最为多见,推测与受试对象如药物、细胞株、动物或组织等的不同有关。

细胞凋亡是一个主动死亡过程,可以被多种内在或外在的刺激诱发,是细胞对刺激的应答反应。本研究根据CCK-8的结果,选择了230 μM的S31-201流式Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测BEL-7402肝癌细胞的凋亡情况,结果显示随着S3I-201作用时间的延长不管是早期凋亡还是晚期凋亡率都明显增加。进一步用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况,结果显示S3I-201能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达和上调促凋亡蛋白Bax的表达。

综上所述,STAT3小分子抑制剂S31-201能够在体外阻滞BEL-7402肝癌细胞周期,使其停滞于S期,抑制BEL-7402的增殖,通过下调Bcl-2和上调Bax 的表达诱导细胞凋亡,更深入的分子机制以及在动物模型中的验证工作仍在进行中。

该研究结果将为靶向STAT3的小分子药物的作用机理及潜在的临床应用提供一些有益的线索。