高效液相色谱法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬

李鑫，代民言，宁星，苗利，王明志

（哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨 150010）

盐酸去氧肾上腺素可缓解感冒、减轻鼻炎导致的鼻塞[1-3]；马来酸氯苯那敏用于治疗过敏性鼻炎、打喷嚏等感冒症状[4-6]；氢溴酸右美沙芬对于延髓中枢产生的咳嗽有一定抑制作用,且没有成瘾性[7-11]。镇咳口服液是由上述3 种成分复配制成,不仅可以治疗感冒、冷空气过敏、支气管炎等疾病引起的儿童咳嗽及鼻塞的症状,同时可以减少马来酸氯苯那敏单独使用时口渴、多尿、咽喉疼痛等的不良反应,提高儿童用药的安全性和顺应性。

现有报道中只有采用高效液相法测定盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬单一主成分或两种主成分的方法[12-15],尚无同时测定3种成分含量的方法,若使用上述方法分别对镇咳口服液中3种成分进行含量测定,则操作繁琐,效率低下。

笔者建立了同一色谱条件下同时测定镇咳口服液中三种主药成分含量的方法,该方法操作简便、快速,专属性强,准确度高,重复性好。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC20A 型,日本岛津仪器有限公司。

电子天平：ALC-110.4 型,感量为0.1 mg,赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

盐酸去氧肾上腺素标准品：质量分数为99.2%,中国食品药品检定研究院。

马来酸氯苯那敏标准品：质量分数为99.7%,中国食品药品检定研究院。

氢溴酸右美沙芬标准品：质量分数为94.8%,中国食品药品检定研究院。

辛烷磺酸钠、甲醇：均为色谱纯,天津益仁达化学试剂厂。

磷酸二氢钠：色谱纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

镇咳口服液样品：批号20190701、20190702、20190703,自制。

缓冲盐溶液：称取磷酸二氢钾1.25 g,辛烷磺酸钠2.5 g,置于1 000 mL容量瓶中,加水定容至标线,pH值为3.0。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：ACE Excel super C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm,英国ACE 公司)；柱温：35 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：220 nm；流动相：A为缓冲盐溶液-甲醇（体积比为92∶8）,B 为缓冲盐溶液-甲醇（体积比为12∶88）,流量为1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱,0～8 min,90%～45% A；8～14 min,45%～32% A；14～20 min,32%～56% A；20～21min,56%～90% A。

1.3 溶液配制

混合标准品溶液：盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬质量浓度分别为0.2、0.08、0.4 mg/mL。精密称取马来酸氯苯那敏标准品10 mg 于10 mL 容量瓶中,用流动相A 定容至标线,得到马来酸氯苯那敏储备液；称取盐酸去氧肾上腺素标准品10 mg、氢溴酸右美沙芬标准品20 mg,精密称定,加入流动相A溶解并转移至50 mL容量瓶中,再加入4 mL马来酸氯苯那敏储备液,用流动相A定容至标线。

混合标准工作溶液：分别吸取混合标准品溶液2、2.25、2.5、2.75、3 mL于10 mL容量瓶中,用流动相A 定容至标线,分别得到对应于镇咳口服液处方含量的80%、90%、100%、110%、120%线性样品浓度。

样品溶液：用移液管吸1 mL 镇咳口服液于10 mL 容量瓶中,用流动相A 定容至10 mL,以3 500 r/min 转速离心5 min,取上清液,用0.22 μm 滤膜过滤,取续滤液作为样品溶液。

阴性样品溶液：参照镇咳口服液配方比例和制备工艺,制备不添加3种主成分的阴性样品。

1.4 实验步骤

取混合标准工作溶液及样品溶液,按照1.2色谱条件下分析,绘制盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬标准工作曲线,计算得线性方程,利用线性方程计算镇咳口服液中三种成分的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

对混合标准品溶液在190～400 nm区间进行扫描,选择有较大吸收的波长220 nm为检测波长。分别考察ACE Excel super C18色谱柱、迪马Diamonsil Plus C18色谱柱,结果表明,同等条件下,ACE Excel super C18型色谱柱分离度最佳,色谱峰宽更小,对称性更好,因此选择ACE Excel super C18型色谱柱为分离柱。

分别考察磷酸二氢钠溶液-甲醇、磷酸二氢钠溶液-乙腈作为流动相的分离效果。结果表明,选择磷酸二氢钠溶液-甲醇作为流动相时,色谱峰形对称,基线平稳。故选择磷酸二氢钠溶液-甲醇作为流动相。

分别考察戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠作为离子对试剂时的分离效果。结果表明离子对试剂烷基链越长,分离度改善明显,因此选择辛烷磺酸钠作为离子对试剂。随着离子对试剂浓度的升高,色谱峰形对称性越好,当辛烷磺酸钠质量浓度高于2.5 g/L 时,分离度合适,色谱峰形理想。同时考虑到离子对试剂浓度过大时,会缩短色谱柱的使用寿命,故最终选择2.5 g/L 辛烷磺酸钠溶液,可使各主成分的色谱峰分离效果最佳,互不干扰。

以缓冲盐溶液-甲醇作为流动相并考察两组分配比对色谱分离效果的影响。结果表明,当甲醇的体积分数增大时,色谱保留时间缩短；甲醇的体积分数减少时,保留时间延长。因镇咳口服液中成分复杂,为实现更好的分离效果,流动相的组成会逐渐改变,使得多种成分在更广泛的条件下被洗脱,故采用梯度洗脱,提高分离效率与检测灵敏度。

调整流动相pH分别为2.0、3.0、4.0,考察流动相pH 值对色谱分离效果的影响。发现随着pH 值降低,色谱保留时间延长,基线分离良好,同时色谱峰形尖锐、对称,考虑分离度、色谱柱耐受性、保留时间等因素,故最终选择流动相pH值为3.0。

2.2 方法专属性

取空白溶剂（流动相A）、混合标准品溶液、阴性样品溶液、样品溶液注入液相色谱仪,记录相应色谱图,各色谱图分别见图1～图4。结果表明,各辅料峰对主药成分色谱峰无干扰,盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬各峰分离度较好。

图1 空白溶剂色谱图

图2 混合标准品溶液色谱图

图3 阴性样品溶液色谱图

图4 样品溶液色谱图

2.3 线性关系

在1.2色谱条件下测定系列混合标准工作溶液,记录色谱图。以溶液的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归,得盐酸去氧肾上腺素线性方程为y=4 957.8x+2 771.8,相关系数r=0.999 9；马来酸氯苯那敏线性方程为y=5 325.9x–193.6,相关系数r=0.999 7；氢溴酸右美沙芬线性方程y=2 168.2x+1 346.1,相关系数r=0.999 8。结果表明盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬的线性范围分别为38.876～64.793 μg/mL、16.256～24.384 μg/mL、76.723～127.872 μg/mL。

2.4 精密度试验

同法制备6份样品,取样品溶液测定,结果见表1。由表1 可知,盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬含量测定结果的相对标准偏差均小于0.5%,表明该方法精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.5 稳定性试验

取样品溶液,分别于室温放置0、2、4、6、8、10、14、18 h,进样10 μL,在1.2 色谱条件下测定色谱峰面积,试验结果见表2。结果表明样品溶液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬色谱峰面积相对标准偏差分别为0.04%、0.17%、0.08%,表明室温条件下,样品溶液在18 h内稳定性较好。

表2 稳定性试验结果

2.6 加标回收试验

取阴性样品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,分别加入4、5、6 mL 混合标准品溶液,用流动相A 定容,即得相对镇咳口服液处方含量80%、100%、120%的加标样品,同法配制3 份,取续滤液测定,结果见表3。由表3数据可知,测得的各点回收率为98.65%～99.65%,表明本方法准确度良好。

表3 加标回收试验结果

2.7 比对试验

分别采用文献[12]方法检测盐酸去氧肾上腺素含量（下称“对照方法1”）,文献[14]方法检测氢溴酸右美沙芬、马来酸氯苯那敏含量（下称“对照方法2”）,所建方法同时检测3 种成分含量,对三批制剂进行对比分析,平行测定6 次,取平均值,测定结果见表4。

表4 不同方法镇咳口服液样品测定结果

采用t检验法对测定结果进行显著性检验,测定结果差异无统计学意义（P＞0.05）,表明本方法与对照方法1、2检测结果都无显著性差异。但两种对照方法需要不同色谱条件,检测步骤比较繁琐；本方法可在同一色谱条件下同时测定3 种成分含量,操作简便。

3 结语

采用高效液相色谱法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬,并进行了方法学验证。该方法精密度好,专属性强,灵敏度高,具有良好的线性关系,为国内的质量标准研究提供了有价值的参考。