气相色谱法测定7-氨基-3-（丙烯-1-基）-3-头孢烯-4-羧酸中溶剂残留量

王文昌，张晓芳，吴娟娟，陈校校，柳慧芳，韩洁

（1.河北晨光检测技术服务有限公司,河北邯郸 057250；2.晨光生物科技集团股份有限公司,河北邯郸 057250）

7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸残留的溶剂无治疗益处,对人的健康有潜在的危害[9-10]。依据药品审批要求,为了更好地控制头孢丙烯产品质量,必须对7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸合成过程中所涉及的残留溶剂进行检测[11]。国家食品药品监督管理总局在2005年颁布了《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》［12］,鼓励药物研发者尝试通过多种途径有效地控制终产品的残留溶剂。国务院办公厅在2016年3 月发布《关于促进医药产业健康发展的指导意见》中提出发展技术精、质量高的医药中间体、辅料、包材等配套产品。除上述规定和指导意见外,一些研究人员也参与药物溶剂残留的研究,如成海平指出：对于原料药来说,合成工艺中使用的有机溶剂均可能在终产品中残留[13]。此外,已有相关研究人员从事于医药中间体的溶剂残留的质量控制研究[14-16]。而在2020 年版《中华人民共和国药典》（ChP2020）中仅有头孢丙烯的溶剂残留量检测方法[17],对7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸没有要求。因此,需要对7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸溶剂残留量进行检测,控制其溶剂残留量,来保证头孢丙烯产品的质量。

检测药物溶剂残留量的仪器方法主要有气相色谱法[18-22]、气相色谱-质谱法[23-24]。作者未查询到7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸溶剂残留量检测相关文献。作者拟采用顶空-气相色谱法对7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸中可能存在的丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃等溶剂残留进行测定,建立相应的检测方法,以期为7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸的质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：GC 2030型,配有氢离子火焰检测器（FID）,日本岛津公司。

顶空进样器：HS-10型,日本岛津公司。

电子分析天平,AUY220 型,感量为0.1 mg,日本岛津公司。

超声波清洗器：TH-600 型,济宁天华超声电子仪器有限公司。

丙酮：色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司。

这么晚了，我一个女孩敢走吗？以前我走过这儿，吓死了，心跳得比鼓点还快。万一车子在这儿抛了锚，那我不死定了？所以我才想找个在坑梓打工的人做伴。

甲醇：色谱纯,德国默克公司。

N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺：色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司。

二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷：色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司。

氢氧化钠：分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。

7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸样品：河北晨光天润制药有限公司。

实验室用水：超纯水,电阻率不小于18.2 MΩ·cm。

1.2 色谱条件

色谱柱：HP-FFAP 毛细管柱（30 m×0.32 mm,0.25 μm,美国安捷伦科技有限公司）；载气：高纯氮气,流量为1.2 mL/min；；进样口温度：220 ℃；进样方式：分流模式,分流比为30∶1；柱箱温度：程序升温,初始温度为40 ℃,保持3 min,以3.5 ℃/min速率升到65 ℃,再以20 ℃/min 速率升到220 ℃,保持5 min；检测器温度：235 ℃；氢气流量：32 mL/min；空气流量：200 mL/min；尾吹气流量：24 mL/min；定量环体积：1 mL；样品平衡时间：40.0 min；平衡温度：80 ℃；流路温度：100 ℃；样品传输线温度：105 ℃。

1.3 溶液的配制

丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准溶液：丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷的质量浓度分别为164.4、169.3、170.5、182.0 mg/mL,分别称取丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷4 110.0、4 231.9、4 261.9、4 550.0 mg 于25 mL 容量瓶中,使用二甲基亚砜溶解并定容至标线,摇匀。

丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准工作溶液：丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷的质量浓度分别为16.4、16.9、17.0、18.2 mg/mL,取丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准溶液1 mL,以二甲基亚砜稀释并定容至10 mL,摇匀。

丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷系列标准曲线溶液：分别移取0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL 丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准工作溶液于25 mL容量瓶中,以二甲基亚砜稀释并定容,配制成丙 酮 质 量 浓 度 分 别 为67.7、135.4、338.6、677.2、1 015.8、1 354.4、1 693.0 mg/L 系列标准工作溶液,甲 醇 质 量 浓 度 分 别 为65.8、131.5、328.8、657.6、986.4、1 315.2、1 644.0 mg/L 系列标准工作溶液,四氢呋喃质量浓度分别为68.2、136.2、340.8、681.6、1 022.4、1 363.2、1 704.0 mg/L 系列标准工作溶液,二氯甲烷质量浓度分别为72.8、145.6、364.0、728.0、1 092.0、1 456.0、1 820.0 mg/L 系列标准工作溶液,现配现用。

氢氧化钠溶液：0.1 mol/L,使用称量纸准确称取0.4 g 氢氧化钠,倒入烧杯中,加入适量蒸馏水超声溶解,搅拌,注入100 mL容量瓶中,冷却后用水定容至标线,摇匀。

样品溶液：用天平准确称取0.1 g 7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸于20 mL 顶空瓶中,使用移液枪加入5 mL的0.1 mol/L氢氧化钠溶液,涡旋、超声溶解,混匀。

1.4 实验方法

准确移取丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准工作溶液和丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷系列标准曲线溶液0.2 mL于盛有5 mL的0.1 mol/L氢氧化钠溶液的20 mL 顶空瓶中,在1.2 色谱条件下,按照浓度由低到高顺序进样分析,以溶液的质量浓度为自变量,所对应的峰面积为因变量进行线性回归,计算校准曲线线性方程。取样品溶液进样分析,以保留时间定性,以色谱峰面积标准曲线法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱、溶剂和柱温的选择

丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃均为极性化合物,根据相似相溶原则,选择HP-FFAP 毛细管柱作为色谱柱。

使用气相色谱法进行溶剂残留测定时,通常以有机试剂或水作为溶剂,而7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸不溶于水、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜,试验结果表明,使用0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为溶剂,样品及目标物均溶解良好。因为氢氧化钠溶液与N,N-二甲基甲酰胺反应,对检测产生干扰,因此选择二甲基亚砜作为溶剂进行标准储备溶液的配制。

丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃均为极性溶剂,且沸点较低,沸点分别为57、65、40、66 ℃,根据气相初始温度的设定原则,将色谱柱的初始温度设为40℃。

2.2 专属性试验

使用移液枪分别量取5 mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶液于2 只20 mL 顶空瓶中,压盖,其中一只加入0.2 mL浓度分别为16.4、16.9、17.0、18.2 mg/mL的丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准工作溶液,涡旋、混匀。以上溶液均按照1.2色谱条件进行测定,记录丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃色谱峰的分离度,气相色谱图见图1、图2。由图1、图2 可看出,0.1 mol/L 氢氧化钠溶液在溶剂出峰时间位置无杂峰,对7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸样品的测定不产生干扰；混合标准对照品溶液中丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃化合物全部实现了基线分离,丙酮和四氢呋喃的分离度为2.1,四氢呋喃和甲醇的分离度为2.7,甲醇和二氯甲烷的分离度为2.3,均大于1.5,满足中国药典定量分析测定要求。

图1 空白样品溶液色谱图

图2 混合标准溶液色谱图

2.3 标准曲线和定量限

分别向盛有5 mL 0.1 mol/L 氢氧化钠的20 mL顶空瓶中加入0.2 mL丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准工作溶液和丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷系列标准曲线溶液,涡旋混匀,按照1.2色谱条件进行测定。以溶液的质量浓度为横坐标、所对应的峰面积为纵坐标进行线性回归,计算线性方程和相关系数。

按取样0.1 g溶解稀释定容至5 mL配制样品溶液,以10 倍信噪比（S/N）计算方法的定量限。线性范围、线性方程、相关系数及定量限见表1。

表1 线性范围、线性方程、相关系数及定量限

2.4 精密度试验

按照1.4实验方法平行称取6份7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸样品于20 mL 顶空瓶中,分别加入5 mL 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液,并加入0.1 mL丙酮、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷混合标准溶液,压盖,得到样品溶液,按照1.2色谱条件进行测定分析,计算测定结果的相对标准偏差,结果见表2。从表2 可知,4 种溶剂测定值的相对标准偏差不大于2.56%,表明本方法的精密度较好。

表2 精密度试验结果

2.5 加标回收试验

按照1.4 实验方法,称取6 份7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸样品于20 mL 顶空瓶中,分别进行低、中、高三水平加标回收试验,样品及加标样品色谱图如图3～图4。样品加标回收率结果见表3。由表3可知,甲醇、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷回收率为92.53%～109.96%,说明方法的准确度较高。

表3 加标回收试验结果

图3 样品色谱图

图4 样品加标色谱图

3 结语

通过对溶剂、色谱柱等条件的优化试验,建立了使用0.1%氢氧化钠溶液溶解7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸样品,顶空气相色谱法测定的方法。所建立的分析方法快速、准确度高（回收率为92.53%～109.96%）,重复性好（RSD不大于2.56%）,分离度符合要求,可用于7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-头孢烯-4-羧酸中甲醇、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷溶剂残留量的日常检测。