气相色谱法测定保健食品中二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚

冯雪萍，张晓庆，杨子忠，李飘然，张慧婷，李亚军

（酵母功能湖北省重点实验室,安琪纽特股份有限公司,湖北宜昌 443003）

大蒜是一种草本植物,长期以来一直被用于各种食品和调味品等制剂中。许多研究表明,大蒜素主要来源于大蒜,是一种有效活性成分的统称,又被称为二烯丙基硫代亚磺酸酯,属于天然抗生素药物,它具有保护心脏、抗菌、提高免疫力等作用,在降压降血脂方面也有重要功效[1-4],因此大蒜素也是研究较多的具有药物学效应的化合物。大蒜素一般是呈油状的无色酯类化合物,伴有大蒜的强烈刺激性气味和特有的辛辣味,易溶于乙醚、苯、正己烷等有机溶剂[5],在高温、碱性环境中不稳定,在偏酸性环境中较为稳定[6-7]。研究表明,新鲜大蒜中含有大量蒜氨酸和蒜氨酸酶[8],当受到物理机械破碎后发生酶促反应,蒜氨酸被蒜氨酸酶催化分解成大蒜素等硫化物,但是大蒜素本身稳定性也较差,又快速分解为挥发性的二烯丙基二硫醚(DADS)和二烯丙基三硫醚(DATS)等硫化物[9],DADS和DATS是大蒜素中重要的两种有效活性成分[10],且DATS 是活性成分最高的有机硫化物,二者均具有较好的抗癌作用[11]。

随着研究的深入,近年来大蒜素的生理功能备受关注,研究表明,大蒜素具有多种生物活性,除了具有抗氧化、抗炎及降压降血脂等作用之外,还具有增强纤维蛋白溶解活性、护肝、抗肿瘤等作用[12-15],因此,大蒜素已应用于食品、化妆品和养殖饲料等多个领域,例如,以大蒜素为原料制成的保健功能食品大蒜油软胶囊深受国内外中老年消费者的喜爱,同时我国也是全球最大的大蒜生产国家,利用现代科学技术开发含大蒜素的保健食品或者化妆品以及畜禽饲料添加剂也具有一定优势。目前市场上大蒜素类保健食品工艺参差不齐,可能会造成相关保健食品的质量问题,而DADS 和DATS 是大蒜素中起作用的活性物质,其含量测定则是检验保健食品的重要质量标准之一。

目前,国内外对大蒜中DADS 和DATS 多采用气相色谱法[16]、高效液相色谱法[17]等方法进行定量分析,但对于大蒜油软胶囊类似产品含量测定方法的研究还鲜有报道,因DADS 和DATS 性质不稳定性,易挥发和分解,准确测定其含量存在一定困难。少部分研究者采用气相色谱-质谱法对大蒜制品中的DADS 和DATS 组分进行测定[18-19],虽然方法简便,结果准确可靠,但不适用于普通实验室的日常检测需求。鉴于大蒜素应用日趋广泛,准确快速测定大蒜素含量极其重要,采用气相色谱法测定不仅操作简单,成本较低,也可广泛用于准确测定保健食品中大蒜素含量,达到既省时又节约成本的目的。依据GB 1886.272—2016《食品安全国家标准 食品添加剂 大蒜油》[20],该方法可用于四种硫化物质定性研究,且未进行相关定量及方法学研究。为有效控制相关产品的质量、快速测定大蒜素含量,笔者利用气相色谱仪对GB 1886.272—2016 中的色谱条件进行了优化,建立了简便、快速、可用于准确测定保健品中DADS 和DATS 含量的方法,可间接判断样品中大蒜素的含量。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：GC 2030 型,配氢火焰离子化（FID）检测器,日本岛津公司。

分析天平：（1）XS 105 型,感量为0.01 mg；（2）ME 204 型,感量为0.1 mg；瑞士梅特勒-托利多公司。

超声仪：KQ-400DE 型,昆山市超声仪器有限公司。

二烯丙基二硫醚(DADS)标准品：纯度（质量分数）不小于99.1%,坛墨质检科技股份有限公司。

二烯丙基三硫醚(DATS)标准品：纯度（质量分数）不小于94.2%,中国食品药品检定研究院。正己烷：分析纯,国药集团化学试剂有限公司。大蒜油软胶囊样品：保健食品,安琪纽特股份有限公司。

实验用水为新制超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：SH-1型毛细管柱（30 m×0.32 mm, 0.25 μm,日本岛津公司）；进样口温度：210 ℃；检测器：FID；检测器温度：210 ℃；载气：氮气,流量为1 mL/min；分流比：10∶1；进样体积：1 μL；升温程序：初始温 度 为100 ℃,保 持5 min,以20 ℃/min 升 至180 ℃,保持13 min。

1.3 溶液配制

稀释剂、空白溶液：均为正己烷。

DADS 和DATS 对照品储备溶液：质量浓度均为25 mg/mL,分别精密称取DADS 和DATS 对照品约250 mg,置于两个10 mL 容量瓶中,用稀释剂溶解、稀释并定容至标线,摇匀。

DADS 和DATS 混 合 对 照 品 溶 液：DADS 和DATS质量浓度均为1 mg/mL,分别精密量取DADS和DATS 对照品储备溶液0.4 mL,置于同一10 mL容量瓶中,用稀释剂稀释并定容至标线,摇匀,即得。

DADS 和DATS 系列混合标准工作溶液：分别精密量取DADS 和DATS 对照品储备溶液适量,用正己烷逐级稀释,得到DADS 和DATS 的质量浓度均分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

取大蒜油软胶囊样品10 粒,挤出内容物并混匀,精密称取1 g,置于25 mL容量瓶中,加入稀释剂至三分之二位置处,超声处理10 min,放至室温,再用稀释剂稀释、定容至标线,摇匀,即得样品溶液。

1.5 实验步骤

移取DADS 和DATS 系列标准工作溶液,依照1.2 气相色谱条件按照浓度由低到高的顺序进样分析,以溶液的质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标进行线性回归,计算校准曲线线性方程。精确称取1 g 样品于25 mL 容量瓶中,用稀释剂定容至标线,混匀,过滤,取1.5 mL 于样品瓶中进样分析,以保留时间定性,以色谱峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

DADS 和DATS 均是挥发性物质,稳定性较差,易挥发和分解。采用气相色谱法测定时,进样口和检测器温度以及升温程序对大蒜制品中DADS 和DATS含量测定有重要影响。若温度偏低则可能导致气化不彻底；若温度过高则可能造成DADS 和DATS 挥发和分解。采用GB 1886.272—2016《食品安全国家标准 食品添加剂 大蒜油》[20]中色谱条件进行分析,色谱图如图1 所示,DADS 和DATS 保留时间分别约为5.4、11.8 min,分析时间较长,不利于快速测定大蒜素含量。经升温程序优化,确定以下色谱条件：样口温度为210 ℃；检测器温度为210 ℃；以氮气为载气,流量为1 mL/min；分流比为10∶1；进样体积为1 μL。采用以下升温程序：初始温度为100 ℃,保持5 min,以20 ℃/min 升至180 ℃,保持13 min。在该色谱条件下,色谱图如图2 所示,DADS 和DATS 分离度可满足要求,其保留时间分别为3.9、7.8 min,整体运行时间缩短一半,分析效率得到大幅提高。

图1 GB 1886.272—2016方法DADS和DATS混合标准溶液色谱图

图2 使用HP-5色谱柱时DADS和DATS混合标准溶液色谱图

色谱柱内涂物质不同也会对目标物质的分离度及含量准确测定等有影响。在其它条件相同的情况下,根据化合物性质选择两个不同品牌的非极性色谱柱HP-5和SH-1进行比较,色谱图分别如图2、图3 所示。结果表明,采用SH-1 色谱柱同样能够使DADS 和DATS 色谱峰完全有效分离,色谱峰对称性好,且保留时间更短,DADS和DATS保留时间分别约为3.4、7.1 min,响应值也相对较高,故选用SH-1型毛细管柱。

图3 使用SH-1色谱柱时DADS和DATS混合标准溶液色谱图

2.2 线性关系

分别利用DADS和DATS对照储备溶液配制成二者质量浓度均分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL系列标准工作溶液,按1.2色谱条件测定,以质量浓度为横坐标（x）,色谱峰面积为纵坐标（y）,进行线性回归,计算线性方程和相关系数。DADS 和DATS质量浓度在0.5～2.5 mg/mL 范围内线性方程分别为y=751 666x-125 748 和y=30 527x+1 699.3,相关系数分别为0.998和0.999 9,表明二者线性良好,满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[21]要求。

2.3 方法检出限

依据检出限定义[22],以S/N大于等于3时所进样浓度为检出限,经逐步稀释对照品储备液后DADS和DATS 的S/N值分别为6 和5,符合检出限实验信噪比法的要求,此时DADS 检出限为0.001 240µg/mL,DATS检出限为0.000 820 0 µg/mL。

2.4 精密度试验

称取6 份大蒜油软胶囊样品,按照1.4 制备6 份样品溶液,过滤,注入气相色谱仪进行分析测定。结果见表1。由表1 数据可知,6 份样品溶液DADS 和DATS测定值的相对标准偏差分别为1.1%和1.3%,表明方法精密度良好,满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求。

表1 精密度试验结果

2.5 加标回收试验

称取已用本法测定DADS和DATS含量的同一批次的大蒜油软胶囊样品6 份于6 只25 mL 棕色容量瓶中,用稀释剂溶解,每份分别加入DADS 25 mg、DATS 11 mg,用稀释剂定容,混匀后过滤,按1.2色谱条件测定,结果见表2,加标样品色谱图见图4。

表2 加标回收试验结果

图4 加标大蒜油软胶囊样品色谱图

由表2可知,6份加标样品中目标物的回收率为95.5%～105.3%,平均回收率分别为102.8% 和96.2%,满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》准确度要求。

3 结语

建立了一种气相色谱法对保健食品大蒜油软胶囊中DADS 和DATS 的含量进行测定。对GB 1886.272—2016《食品安全国家标准 食品添加剂 大蒜油》中程序升温步骤进行优化,既可达到使样品中各组分在整个分析时间段能够有效分离的目的,又可以节省分析时间。该检测方法将检测效率提高一倍且通用性强。与其它同类检测方法如定量分析采用的气相色谱-质谱法相比,该方法作为产品常规检测使用,成本大大降低。该方法准确可靠,具有较高的精密度,可以快速、高效、准确的检测保健食品中大蒜素的含量。