保和消积方体外对胃癌细胞增殖和迁移的影响及其机制研究

徐春丽 张晓阳 顾宏伟 高建忠

(1 南京市中西医结合医院,南京,210014; 2 山西省中西医结合医院,太原,030013)

胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一,我国是胃癌高发国家,发病率和死亡率均约占全球的50%[1]。目前胃癌的治疗主要以手术联合化疗为主,根治性手术可以切除原发病灶,但在术后有较高的复发转移率,且大多数患者确诊时已属晚期,失去手术机会;术后辅助放化疗,可控制微转移病灶,但会出现严重的不良反应和耐药性,而中医药在抑制胃癌、减轻化疗不良反应方面具有一定的优势[2],因此,寻求有效的中医药治疗成为目前研究的热点。

基于此,在当代医家主张的病因病机的基础上,高建忠教授以保和消积方治疗胃癌,经多年临床实践验证,疗效良好。保和消积方能取得良好的临床疗效得益于该方以保和丸为底方,所加药物(三棱、莪术、白花蛇舌草)更能消癌散结。该方重用焦山楂消食化积;二陈汤主治痰湿;白花蛇舌草清热解毒,消痈散结[3];三棱、莪术相须而用,破血行气,消积止痛,增强破血消瘤止痛之功[4]。但目前关于保和消积方对胃癌细胞增殖、迁移的影响及其可能的作用机制研究较少。

微血管形成与胃癌细胞生长与转移存在密切关系,血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)为促血管生长因子,能诱导新生血管形成[5],还有磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)信号通路与恶性肿瘤的相关性成为研究热点,PI3K-AKT-mTOR信号通路与胃癌密切相关[6],该信号通路激活可维持细胞存活,是肿瘤细胞抵抗凋亡的重要机制之一[7],但关于其在保和消积方治疗胃癌中的作用少见报道。本研究将通过观察保和消积方对体外胃癌SGC-7901细胞株生长增殖、凋亡及转移能力的影响,并通过观察保和消积方对胃癌SGC-7901细胞微管生成和血管内皮生长因子的影响,探讨保和消积方抑制胃癌细胞的效果,并基于PI3K-AKT-mTOR信号转导通路分析其作用机制,为胃癌的治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 胃癌SGC-7901细胞株购自璟源生物科技有限公司(批号：C6795),培养于添加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS,Thermo Fisher Scientifc公司,美国,批号：SH30084.02)、100 U/mL青霉素(河南仟德药业有限公司,批号：130437-201707)和链霉素(深圳市贝尔医药科技有限公司,批号：130308-201514)的RPMI-1640培养液中,并置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中常规培养,用含乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化传代种板,放入-80 ℃冰箱保存备用。本研究经南京市中西医结合医院医学伦理委员会审批通过。

1.1.2 药物 保和消积方中药购自南京中西医结合医院中药房(批号：684339),保和消积方的配方为：焦山楂30 g、姜半夏9 g、陈皮9 g、茯苓9 g、三棱9 g、莪术9 g、白花蛇舌草30 g。加水浸泡30 min,煎成60 mg/L的浓缩浸膏,滤网过滤除菌后,分装放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 RPMI-1640培养液(Corning公司,美国,批号：WH0021F221),p-PI3K(货号：20583-1-AP)、p-AKT(货号：60203-2-lg)、p-mTOR(货号：20657-1-AP)抗体购自美国Proteintech公司,噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide,MTT]细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司,批号：BJ-S963550),膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号：C1062M),PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒(Takara公司,日本,批号：RR037Q),ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,批号：Q311-02)。CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific公司,美国,批号：320),倒置光学显微镜多功能酶标仪(Molecular Devices公司,美国型号：Molecular Devices SpectraMax M3),全自动高速流式细胞仪(BD公司,美国,型号：BD FACSCalibur),高速离心机(Hettich公司,德国,型号：MIKRO220R),生物安全柜(AIRTECH公司,型号：BSC-1004IIA2),细胞计数仪(Inno-Alliance Biotech公司,美国,型号：Countstar IC 1000)。

1.2 方法

1.2.1 分组 根据保和消积方的关键成分三棱、莪术实验计量浓度[8],设置不同质量浓度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消积方稀释液组作为观察组,同时另设空白对照组不做药物处理。

1.2.2 给药方法 收集处于对数生长期的SGC-7901胃癌细胞,经胰酶消化后进行细胞计数,根据不同实验内容调整细胞浓度,种板至相应孔板中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜培养。次日,向各孔中加入不同质量浓度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消积方稀释液,另设空白对照组,根据下述实验需要分别孵育24 h,48 h及72 h。孵育完成后,根据后续试验要求进行检测。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 细胞MTT试验 收集处于对数生长期的SGC-7901胃癌细胞,细胞计数,调整细胞浓度,使用96孔板进行实验,每孔加入100 μL细胞悬液,细胞浓度约为2 000个/孔。于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育,过夜培养,待细胞贴壁后,根据健脾养胃方的关键成分三棱、莪术实验计量浓度[8],设置加入不同质量浓度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消积方稀释液,另设空白对照组,孵育后,在倒置显微镜下观察。然后,每孔加入10 μL MTT溶液(质量浓度为5 mg/mL),继续培养4 h后,弃掉上清液,加入150 μL二甲基亚砜(Methyl Sulfoxide,DMSO),置于摇床上振荡10 min,使结晶物充分溶解。分别在24 h、48 h、72 h在酶联免疫检测仪上于570 nm处测量各孔的吸光度。

细胞生长抑制率=(1-观察组吸光度/空白对照组吸光度)×100%。

1.2.3.2 细胞Transwell迁移试验 实验前至少2 h,用培养液完全浸泡Transwell上下室。提前饥饿细胞12 h,去除血清影响;消化细胞,中止消化后离心弃去培养液;磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗2次,以充分去除血清;用含牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)的无血清培养基重悬细胞,调整细胞密度至5×105个/mL。取细胞悬液100 μL加入Transwell小室。24孔板下室加入500 μL含20%FBS的培养基,注意：下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板,培养12～24 h,取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,PBS洗2次,甲醇固定30 min,将小室适当风干,0.1%结晶紫染色20 min,PBS洗3次,倒置显微镜下随机4个视野观察细胞、记数和拍照。

1.2.3.3 细胞凋亡的流式细胞术检测 取对数生长期的胃癌SGC-7901细胞,接种到6孔板(5×105个/孔),每孔2 mL培养液,培养24 h后,加入不同质量浓度的保和消积方稀释液处理细胞,培养48 h后收集各组细胞,把细胞培养液吸出至1个合适的离心管内,PBS洗涤贴壁细胞1次,加入适量胰酶细胞消化液(无EDTA)消化细胞。1 000×g,离心5 min,弃上清液,收集细胞,用PBS轻轻重悬细胞并计数,1 000×g,离心5 min,弃上清液,调整细胞浓度至1×106个/mL,加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC,轻轻混匀,加入10 μL碘化丙啶染色液,轻轻混匀,室温(20～25 ℃)避光孵育10～20 min,孵育过程中重悬细胞2～3次以增强染色效果,随后置于冰浴中,使用铝箔进行避光。立即上机用流式细胞仪检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色为红色荧光。

1.2.3.4 定量PCR检测AKT、mTOR、PI3K、VEGF的mRNA表达 各组细胞处理24 h,TRIzol法提取总mRNA,用焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate,DEPC)水溶解总mRNA。然后按照逆转录试剂盒说明书操作,依次经过去除基因组DNA反应、逆转录反应和实时荧光定量PCR,扩增程序为预变性：95 ℃、10 min。扩增：95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,40个循环。用2-△△Ct法计算目的基因AKT、mTOR、PI3K、VEGF的mRNA含量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3.5 微管形成试验 实验前将无菌枪头、无菌EP管提前放入4 ℃冰箱预冷;从-20 ℃冰箱中取出Matragel基质胶提前4 ℃解冻,与无血清培养基按照1∶1比例稀释;在冰上铺胶,每孔加入200 μL Matragel基质胶,避免产生气泡;铺胶后将48孔板在4 ℃冰箱内放置10 min,在培养箱中孵育30 min,使之成为小管形成培养基,将SGC-7901细胞消化、离心后,取SGC-7901细胞上清重悬细胞;然后每孔加入200 μL细胞悬液,在恒温CO2培养箱中孵育4 h后,在倒置显微镜下观察微管形成结果。每组设3个副孔,实验重复3次;在100倍显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数统计。

1.2.3.6 蛋白质免疫印迹法检测蛋白表达水平 提取经含有不同浓度(0、0.5、1、2、4、8、12、16 mg/L)保和消积方处理的SGC-7901细胞,24 h后收集SGC-7901细胞并用放射免疫沉淀(Radio-Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液冰上裂解30 min,离心30 min(8 000×g,4 ℃),取上清液获得蛋白样品,用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)定量试剂盒定量并计算蛋白的含量。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,用半干转膜仪进行转膜。转膜结束后,使用一抗快速封闭液封闭30 min,一抗的比例分别为p-PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000),用聚对苯二甲酸丁二酯(Poly Butylene Terephthalate,PBT)洗膜3次,放置4 ℃孵育过夜,PBT洗膜3次,放入二抗中室温下孵育1 h,用PBT洗膜3次,加入超敏化学发光(Efficient Chemiluminescence,ECL)发光显色,浸润聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,用凝胶成像系统拍照分析,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)为内参。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,所有实验重复3次,组间两两比较采用Duncan法比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 保和消积方对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 细胞MTT法分析结果表明,随着保和消积方质量浓度的增加,SGC-7901细胞的增殖抑制率呈现线性增加,当保和消积方质量浓度为16 mg/mL时,药物对SGC-7901细胞的抑制率接近100%,达到阈值。在同一浓度下,随着药物处理时间的延长,保和消积方对SGC-7901细胞的增殖抑制率增加。与空白对照组比较,保和消积方分别在同一时间下各观察组的SGC-7901细胞增殖抑制率均呈现极显著升高(均P<0.01)。见图1。

图1 不同保和消积方对SGC-7901细胞增殖的抑制作用

2.2 保和消积方对胃癌细胞SGC-7901迁移的影响 细胞Transwell迁移试验结果显示,与空白对照组比较,随着保和消积方质量浓度的增加,SGC-7901细胞迁移的细胞数量显著减少(均P<0.05)。见图2～3。

图2 不同浓度保和消积方对胃癌SGC-7901细胞迁移的抑制作用

图3 各组胃癌SGC-7901细胞穿膜细胞数

2.3 保和消积方对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响 流式细胞术检测SGC-7901细胞凋亡结果显示,与空白对照组比较,保和消积方处理组的SGC-7901细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均有所增加,且随着保和消积方质量浓度的增加而增加,当保和消积方质量浓度为12 mg/mL时,早期的凋亡率最高,达到23.66%;当保和消积方质量浓度为16 mg/mL时,晚期的凋亡率最高,达到54.74%。见图4。

2.4 保和消积方对胃癌细胞SGC-7901的AKT、mTOR、PI3K、VEGFmRNA表达的影响 与空白对照组比较,随着保和消积方浓度的增加,SGC-7901细胞中mTOR、PI3K、VEGFmRNA含量均呈现下降趋势,AKT mRNA含量先降后升,整体呈现下降趋势,当保和消积方质量浓度≥1 mg/mL时AKT含量显著下降(P<0.05),其中4 mg/mL组的AKT mRNA表达量最低;当保和消积方质量浓度≥0.5 mg/mL时mTOR含量显著下降(P<0.05),其中16 mg/mL组的mTOR mRNA表达量最低;当保和消积方质量浓度≥2 mg/mL时PI3K含量显著下降(P<0.05),其中16 mg/mL组的PI3K mRNA表达量最低;当保和消积方质量浓度≥1 mg/mL时VEGF含量显著下降(P<0.05),其中16 mg/mL组的VEGF mRNA表达量最低。见图5。

图5 保和消积方对SGC-7901细胞AKT、mTOR、PI3K、VEGF的qPCR表达

2.5 不同浓度保和消积方对SGC7901细胞PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路的影响 与空白对照组比较,不同浓度保和消积方(1～16 mg/mL)的胃癌SGC-7901细胞p-AKT、p-mTOR、p-PI3K和VEGF蛋白表达水平明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05),并呈现浓度相关性。见表2。

表2 不同浓度保和消积方对SGC7901细胞PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路的影响

2.6 保和消积方对胃癌SGC-7901细胞微管形成的影响 空白对照组的SGC-7901细胞在Matrigel胶上已形成良好的管样结构,添加不同浓度的保和消积方后,SGC-7901细胞管样结构均受到破坏,随着保和消积方浓度的增加,SGC-7901细胞管样结构越来越少。见图6。与空白对照组比较,保和消积方质量浓度1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL、16 mg/mL管样结构数目均显著减少(均P<0.01),当保和消积方质量浓度为16 mg/mL时,细胞管样结构数目下降最多,下降85.71%。见图7。

图6 不同浓度保和消积方对胃癌SGC-7901细胞微管形成的抑制作用(多聚甲醛固定,×200)

图7 不同浓度保和消积方对胃癌细胞SGC-7901微管生成数量的影响

3 讨论

中医治疗胃癌,当代医家多从脾胃虚等致病因素着手,为肿瘤的中医药防治作出了巨大的贡献。刘沈林教授多年来致力于消化道肿瘤的临床研究与科研工作,他治疗胃癌的经验方组成为：炙黄芪、党参、炒白术、当归、白芍、半夏、陈皮、三棱、莪术、白花蛇舌草、炙甘草[9]。保和消积方即为该治法指导下的临床常用处方,功用健脾益气,理气和胃,临床可显著改善胃癌患者的生命质量,降低肿瘤标志物水平,延缓胃癌的复发和转移[10-11]。

有研究表明中药可以从抗血管生成方面发挥独特的防治胃癌的作用[8]。自从Folkman提出假说,肿瘤生长和转移依赖血管生成,阻断血管生成是肿瘤的治疗策略,到如今,这个观点已得到广泛认可并持续成为肿瘤研究的热点。在胃癌组织中PI3K/AKT/mTOR信号转导通路上关键基因存在异常表达,同时该信号通路异常激活与肿瘤分化、淋巴结转移及预后密切相关,但从阻断血管生成和PI3K/AKT/mTOR信号通路两方面来研究胃癌的报道较少。本研究采用保和消积方体外培养的胃癌SGC7901细胞,观察到保和消积方不仅可通过阻断血管生成,也可以通过PI3K-AKT-mTOR通路影响胃癌SGC7901细胞的增殖、凋亡。

胃癌细胞具有很强的增殖、侵袭和迁移能力[12]。研究报道,保和消积方中多个单味中药均有抗肿瘤的功效,陈皮的现代药理学研究表明陈皮中的陈皮多甲氧基黄酮、川陈皮素具有显著的抗肿瘤效果,半夏提取物对肉瘤、宫颈癌、肝癌等体外实验均有抑制作用,临床报道半夏在胃癌中也可取得比较好的疗效[13-14]。张莹等[15]发现,三棱-莪术组方通过降低SGC-7901细胞移植瘤裸鼠血清环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、VEGF和重组人碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的水平从而达到抑制SGC-7901移植瘤生长的作用。HAO等[16]证实茯苓可以有效地抑制AKT的磷酸化(Thr308),并通过AKT介导的信号转导通路抑制胃癌SGC-7901细胞增殖侵袭和促进其凋亡;另有研究报道,白花蛇舌草在肿瘤治疗中具有更好的效果,可降低患者的血清肿瘤标志物水平[17]。本研究结果显示,保和消积方可以抑制胃癌细胞系体外的增殖,且对细胞的抑制作用呈现时间相关性和浓度相关性,进一步利用流式细胞仪检测胃癌SGC-7901细胞的凋亡率,结果表明不同浓度保和消积方的胃癌细胞凋亡率均显著高于空白对照组,揭示保和消积方抑制细胞分裂,促进其凋亡,并且其可能通过诱导细胞凋亡从而抑制细胞增殖。

PI3K-AKT-mTOR信号通路参与调控胃癌细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学功能[18],为了进一步探讨保和消积方对胃癌细胞增殖、凋亡的作用机制,本研究观察了PI3K-AKT-mTOR信号通路在其中的作用。机体在失调的状态下,PI3K会集中到细胞膜,促进AKT蛋白磷酸化而活化,进一步激活下游mTOR,激活的AKT和mTOR通过多种途径促进癌细胞生存,抑制凋亡的发生[19]。相关研究也报道了PI3K-AKT-mTOR通路可促进前列腺癌细胞增殖、转移,并诱导癌细胞凋亡[6,20]。另外,通过靶向治疗可抑制癌细胞中PI3K-AKT-mTOR信号通路及癌细胞增殖[21]。本研究发现,不同浓度保和消积方均显著降低了PI3K-AKT-mTOR的mRNA和蛋白表达水平,浓度越高表达量越低,揭示保和消积方通过抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化表达,抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路,从而诱导SGC-7901细胞凋亡,进而抑制细胞增殖。

另有研究已被证实VEGF是胃癌细胞中重要的促血管生成因子[22],它能诱导内皮细胞的增殖与迁移,诱导细胞脉管形成。陈海姣等[23]发现巴佛洛霉素A1能够通过抑制空泡型ATP酶(Vacuolar-type ATPase,V-ATPase)的活性来抑制胃癌SGC-7901细胞VEGF的表达和新生血管的形成,进而抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。研究证实,健脾养胃方能够下调VEGF mRNA水平及蛋白表达,从而抑制胃癌细胞的血管生成,进而抑制胃癌细胞的增殖与迁移[24]。本研究中保和消积方能够抑制胃癌细胞SGC-7901细胞微管的形成，不仅细胞管样结构的数量显著降低，其血管生成相关基因VEGF表达水平也有显著降低，进一步检测细胞的Transwell迁移能力，发现细胞的迁移能力明显降低，提示了保和消积方可以通过降低胃癌细胞SGC-7901细胞VEGFmRNA的表达量，进而抑制胃癌细胞血管生成和迁移。

综上所述,保和消积方通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路激活,进而抑制了细胞SGC7901增殖,从而诱导胃癌细胞的凋亡,同时下调了VEGFmRNA的表达,降低胃癌细胞血管生成,进而抑制了、胃癌细胞的增殖与迁移。本研究只是初步探索了保和消积方对胃癌细胞SGC7901细胞有明显的抑制增殖、迁移、血管生成作用,但其具体的调控机制有待进一步研究。

利益冲突声明：作者声明,不存在与工作责任相冲突的任何经济和非经济利益,保证该研究的独立性和科学性。