黄芪甲苷对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及机制研究进展

赵歆伊 贺永贵

1华北理工大学临床医学院 河北唐山 063000;2附属医院神经内科

缺血性卒中(cerebral ischemic stroke, CIS)又称脑梗死(cerebral infarction, CI)是由于脑动脉血流供应障碍导致局部脑组织缺血、缺氧性损伤及梗死,从而出现相应的神经功能缺损症状,其病理生理机制复杂,涉及能量供应不足、线粒体损伤、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、氧化应激和自噬等,最终导致细胞坏死或凋亡[1-2]。因此,即使能够在时间窗内行静脉溶栓、动脉取栓等再灌注治疗使缺血脑组织快速恢复血液供应,仍可能出现一系列复杂的缺血级联反应,继续损伤脑组织,其中脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)在众多机制中发挥关键作用。

近年来,应用中医药治疗缺血性脑血管病已逐渐成为研究的热点之一。中药黄芪是一种补气固表的中药补益药[3],可用于脑血管病等多种疾病的防治[4]。黄芪甲苷(astragaloside IV, AS-IV)在黄芪众多成分中起关键作用,具有抗炎、抗氧化、增强免疫、神经保护等多种生物学作用[5],被认为是判定黄芪质量优劣的标准[6]。AS-IV能够使卒中后大鼠脑梗死体积明显缩小[7],促进新生血管形成、抑制缺血区细胞凋亡及炎症反应[8],降低血脑屏障通透性,减轻脑水肿[9],缓解脑组织损伤及神经功能缺损症状。本文主要综述AS-IV对CIRI的神经保护作用机制及其进展,为AS-IV应用于CIS的临床治疗提供更多理论依据。

1 抑制炎症反应

神经炎症最初是大脑的一种自我保护反应,但是过度的炎症反应会导致脑损伤。脑缺血后大量炎症因子被释放,白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等是脑损伤过程中重要的炎性细胞因子,在炎症反应中起着关键作用。CIRI过程中产生过量的一氧化氮(NO)与缺血区产生的自由基相结合,双方相互作用、相互影响,导致血脑屏障破坏、酸中毒、蛋白质分解等,进一步加剧脑损伤。AS-IV能够通过上调大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠脑组织中沉默信息调节因子1(silent information regulator of transcription 1, SIRT1)的表达,抑制TNF-α和IL-1β mRNA表达及CIRI后炎性介质的释放,进而抑制CIRI后的炎症反应[10]。研究显示,CIRI后脑组织中IL-1β、IL-18等炎性因子含量明显增加,抑制IL-1β、IL-18及核因子-κB(NF-κB)蛋白磷酸化能够减轻CIRI,而AS-IV能够减轻脑组织损伤,其作用机制可能与调节NF-κB蛋白磷酸化表达,进而调控NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)的炎症小体活化进而抑制炎症反应有关[11-12]。上述研究表明,CIRI后炎症因子含量明显增加,AS-IV可通过阻止炎性因子的释放进而抑制CIRI过程中的炎症反应,改善脑组织损伤。

2 抑制氧化应激

缺氧在脑血管疾病中较为常见,而持续存在的缺血缺氧微环境将会造成氧化应激损伤,体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)过度堆积,致使脂类、蛋白质及DNA变性、损害血管内皮,最终导致细胞凋亡,加重脑组织损伤[13-14]是CIRI发生发展的关键因素。因此,增强脑组织抗氧化能力对改善脑损伤至关重要。Zheng等[15]研究显示在体外实验中AS-IV能够激活Janus激酶2(janus kinase 2, JAK2)/转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)途径减轻细胞氧糖剥夺-再恢复(oxygen glucose deprivation reoxygenation, OGD/R)诱导的细胞凋亡,减轻氧化应激损伤;在体内实验,应用AS-IV对大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)模型大鼠进行预处理,能够明显缩小脑梗死体积,增强超氧化物歧化酶(SOD)活性,明显降低丙二醛(MDA)及ROS含量,激活p-JAK2、p-STAT3蛋白表达,此作用被AG490(JAK2抑制剂)所逆转,表明AS-IV能够清除CIRI相关活性氧自由基进而抑制氧化应激反应,其作用机制与JAK2/STAT3信号通路有关。此外,靳晓飞等[16]研究显示,OGD/R能够诱导激活自噬进而导致氧化应激损伤;而AS-IV使细胞内MDA含量明显减少、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性明显增强,自噬小体数量及自噬效应蛋白1(beclin1 protein, Beclin1)表达明显增多,而自噬抑制剂3-MA能够阻断AS-IV的作用,表明AS-IV能够通过调控自噬水平减轻氧化应激反应,改善脑组织损伤。以上研究表明,AS-IV能够通过清除体内氧自由基、提高抗氧化酶活性及含量抑制CIRI过程中的氧化应激反应而发挥神经保护作用。

3 抑制细胞凋亡

细胞凋亡是由于受到外界因素的刺激后细胞发生有序死亡的过程,其发生发展与多种炎性反应、凋亡相关的因子、信号通路等因素密切相关。细胞凋亡是 CIRI后继发脑功能损害的重要因素,因此抑制细胞凋亡可能是防治 CIRI的一个重要途径。张怡等[17]通过OGD/R模拟 CIRI过程,结果显示OGD/R后细胞活性显著降低,Bax /Bcl-2显著增加,AS-IV能够明显增强细胞活性,降低Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)/B淋巴细胞瘤基因-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)值,而3-MA显著逆转AS-IV的作用,说明AS-IV能够通过激活自噬抑制细胞凋亡,缓解CIRI。研究显示AS-IV还能够显著下调P62、mTOR、Caspase-3 mRNA及蛋白的表达水平,上调微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1 mRNA以及蛋白表达水平,改善缺血脑组织神经元损伤[18]。AS-IV还可通过激活自噬、上调局灶性脑缺血大鼠的自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平,从而增加自噬体数量,抑制CIRI后尼氏体的减少,缩小脑梗死体积,从而发挥神经保护作用[19]。此外,AS-IV能够促进核因子E2相关因子2(nuclearfactor-E2-relatedfactor2, Nrf2)活化,上调P62和Nrf2表达水平,下调Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like epichlorohydrin-related protein-1,Keap1)表达水平,抑制细胞凋亡,而AS-IV的作用被Nrf2抑制剂ML385所逆转,表明AS-IV可通过P62/Keap1/Nrf2信号通路抑制细胞凋亡减轻CIRI[20]。Li等[21]以脑缺血大鼠为研究对象,其实验结果显示AS-IV治疗能够缩小脑梗死体积,改善脑缺血大鼠的神经功能,增加缝隙连接蛋白(Cx36)和蛋白激酶A(PKA)表达水平,降低Bax/Bcl-2的比值,而此结果被PKA抑制剂H-89所抑制,说明AS-IV能够抑制细胞凋亡减轻大鼠CIRI,其神经保护作用可能与上调Cx36和PKA蛋白的表达有关。此外,还有研究显示,AS-IV处理实验性大鼠后,能够显著下调Caspase-8和Bax/Bcl-2 mRNA的表达,缩小脑缺血大鼠脑梗死面积,改善神经功能缺损情况进而抑制细胞凋亡发挥神经保护作用[22]。以上研究表明,AS-IV可通过多种途径抑制细胞凋亡从而改善CIRI。

4 保护血脑屏障

血脑屏障(blood brain barrier, BBB)由连续血管内皮及其细胞间的紧密连接、完整的基膜、周细胞以及星形胶质细胞的神经胶质膜构成,能够阻止循环血液中的有害物质入侵脑组织,其完整性对保持脑稳态以及维持中枢神经系统正常生理功能具有重要意义。在CIRI过程中,血脑屏障的完整性被破坏、通透性增加,导致其丧失对脑的保护功能,直接引发脑水肿以及相关免疫细胞和炎症物质入脑,出现脑损伤、神经元死亡等。因此,促进血管内皮增生、恢复血脑屏障完整性或减少血脑屏障开放,使药物有效地递送至脑内对治疗脑损伤至关重要。Hou等[23]研究显示,AS-IV可通过抑制蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)/ C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)信号通路,抑制PERK和eIF2α、Bip和CHOP磷酸化及凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达水平,减少实验性CIRI大鼠脑梗死面积,抑制内质网应激、减少内皮细胞的凋亡,保护血脑屏障的完整性。AS-IV还可通过激活Nrf2信号通路,上调紧密连接蛋白(occludin)及闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)的表达水平,下调血管内皮细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)表达,抑制CIRI后血脑屏障通透性增高,减轻脑组织水肿[24]。以上研究表明,AS-IV可通过多通路维护血脑屏障的稳定性,对脑缺血损伤发挥保护作用。

5 抑制免疫反应

脑缺血的早期,自然杀伤(nature killer,NK)细胞可被缺血神经元募集入脑,增加局部炎症反应、破坏血脑屏障,加剧脑内神经元的死亡[25]。卒中引发的免疫抑制使患者更易并发感染,预后不良;而NK细胞作为先天免疫的重要组成部分,可通过杀死受感染细胞,在早期宿主抵御病原体中发挥关键作用[26]。邹莹香等[27]通过大脑中动脉栓塞法建立小鼠CIRI模型,实验结果显示脑缺血24h后,模型组小鼠脾脏萎缩显著,脾脏及外周血NK细胞减少明显,AS-IV处理后小鼠脾脏及外周血中NK细胞比例明显升高、脾脏质量增加,同时使自然杀伤细胞受体2D(natural killer group 2D,NKG2D)的表达上调。上述研究结果表明, AS-IV 能够改善脑损伤后的外周免疫抑制。还有研究显示AS-IV能够通过减轻缺血脑组织对NK细胞的募集,抑制了 NK 细胞来源的干扰素γ ( IFN-γ)和NKG2D的表达从而减轻 CIRI,其神经保护机制可能与对STAT3的抑制作用有关[28]。此外,还有文献报道,通过活化过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor,PPARγ),AS-IV能够靶向抑制p-NF-κB,逆转NF-κB/NLRP3信号通路,减轻实验性小鼠免疫炎性反应,明显削弱CD4+T淋巴细胞向调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)及辅助性T细胞17(T help cell 17, Th17)亚型分化,改善实验小鼠的神经功能[29]。由此可知,AS-IV能够通过抑制免疫反应发挥抗CIRI作用。

6 促进神经干细胞增殖、分化

脑缺血可导致脑内神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞及内皮细胞等神经细胞的损伤或坏死,由于神经元的可塑性和神经元回路的功能重构,可通过激活内源性神经干细胞(neural stem cells, NSCs)使其迁移到脑损伤部位,进而增殖、分化为新的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞等神经细胞,或是移植外源性的神经干细胞,参与神经回路的形成,逆转或部分恢复脑神经损伤,促进损伤大脑结构和功能的修复。因此,维持神经干细胞的存活与生长、保护神经干细胞,促进神经功能恢复,在修复脑组织损伤中尤为关键[30-33]。Ni等[34]研究显示,AS-IV能够减小MCAO大鼠脑梗死体积,改善其感觉及运动功能,刺激其神经功能恢复,促进海马内神经干细胞的迁移、增殖、分化及成熟从而缓解CIRI,其作用机制可能与上调脑源性神经营养因子(BNDF)/酪氨酸激酶受体B(TrkB)信号通路发挥神经保护作用有关。可见,AS-IV具有较强的促进神经干细胞增殖、分化的能力,进而促进CIRI导致的神经损伤恢复,加速神经功能恢复。

综上所述,AS-IV能够通过抑制炎症反应、减轻氧化应激、抗细胞凋亡、保护血脑屏障、改善免疫抑制、促进神经干细胞增殖分化等途径发挥神经保护作用,能够多靶点、多途径改善CIRI,对CIS的治疗和预防具有重大意义。由于CIS的发病机制复杂多变,AS-IV口服生物利用率低等,因此对于AS-IV改善CIRI的具体作用机制及临床应用还需进一步探讨,以期为临床治疗缺血性脑血管病以及改善患者预后提供新思路。