幽门螺杆菌感染分子生物学检测样本的研究进展

闫松 刘玥 景丽伟 王婧涵 刘军 张超

1华北理工大学附属医院消化内科 河北唐山 063000 ;2首都医科大学护理学院;3华北理工大学临床医学院

幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)是一种存在于胃幽门、依附定植于胃上皮细胞的革兰氏阴性菌[1],按毒力与致病性主要分为两型:Ⅰ型HP具有毒力基因,通过注射器样结构将产生的毒力蛋白注入宿主细胞,破坏宿主细胞结构,易引起胃癌[2];Ⅱ型HP菌株由于不能产生细胞毒素,故毒力低,感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎[3]。此外,HP感染呈现明显的家庭聚集性,其主要通过口-口、粪-口传播,也存在通过食物和水传播的可能[4]。因此,选择合理的检测样本与诊断方法以准确诊断HP感染对预防交叉感染及胃癌发生有重要意义。检测HP感染有多种方法:侵入性方法可直接在内镜下观察胃黏膜情况,也可通过黏膜活检进行快速尿素酶试验、组织病理检查和细菌培养;非侵入性方法有尿素呼气试验、粪便抗原和血清学抗体检测等,但均受样本种类、菌量、细菌活性限制。不同检测方法间各具优劣势,尤其是诊断效能良莠不齐。近年来,随着分子生物技术的大幅进步,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)等基于生物分子检测HP感染方法已逐渐成为更为精准可靠的检测手段。

PCR是最主要和常用的分子生物学方法[5]。本文以其为检测方法进行综述。PCR可以检测样本中的核酸,在区分菌株分型、药敏试验等方面具有独特的优势,明显提高了HP诊断的敏感性和特异性[6]。同时,PCR可检测的感染样本种类和范畴也不断扩增,目前已由人体样本(主要包括侵入性的胃黏膜活检组织、胃液;非侵入性的唾液、牙菌斑、粪便等)逐渐拓展至周围环境样本(饮用水、食物等),扩大了PCR检测样本的多样性[7]。PCR检测在不同样本中诊断效能参差不齐,取样用途也有所不同。本文对PCR检测不同样本中HP的取样方法、诊断效能及优劣势进行综述。

1 侵入性样本

侵入性HP检测的样本主要包括:胃黏膜、胃液。因基于胃黏膜活检的HP检测具有更高的灵敏度、特异度,实验室研究通常将胃黏膜样本视为诊断HP的参考标准。准确诊断胃内HP,对消化道疾病的发生及进展具有重要意义。

1.1胃黏膜

1.1.1胃黏膜的样本检测 胃黏膜是HP侵入性检测方法中最常用的标本选择[8]。HP依靠尿素酶系统降低胃酸,在胃内极低的pH环境中定植[9]。取样需在患者接受抗生素治疗之前,通过内镜,于胃窦和胃体采集2～4块样本,固定后分离、提取DNA[10]。Saez等[11]通过研究158名消化系统疾病患者,得出PCR检测消化道出血HP感染的灵敏度为68.4%,非消化道出血HP感染的灵敏度为91.5%。可见,消化道出血患者HP感染可能无法通过传统方法如组织学或快速尿素酶试验正确诊断,这些患者可以从分子生物学诊断中获益。

1.1.2胃黏膜样本的优势与劣势 通过PCR法检查胃黏膜样本,具有如下优点:(1)不受HP细菌数量影响:PCR具有较高的灵敏度,少量的HP就可被检测,为判断是否根除彻底提供依据[8];(2)不受HP形态学影响:PCR可基于分子生物学特征,特异性的将HP与其他形态相近菌种(如空肠弯曲菌、海曼氏螺杆菌)相区分,诊断能力优于组织病理学等[12];(3)不受HP生存条件影响:当出血、饮酒、药物等对培养成功率有影响时,PCR对胃黏膜的检测取样未明显受生长环境影响,诊断效率明显优于HP培养[13];(4)可同时明确细菌分型及耐药情况:可定量测定及提供药敏、毒力等信息,有助于制定合适的个体化治疗方案[6]。

基于胃黏膜样本的PCR检测,也可能受样本组织获取过程及样本质量的影响。主要体现在如下方面:(1)取样过程受多方因素影响:组织样本多是医生通过内镜进行获取,样本质量受医生内镜操作活检技术水平、患者的内镜耐受性及依从性、内镜及活检钳器械质量等的影响[12]。Bakhtiari等[14]通过77例研究结果发现,将PCR视为金标准时,环介导等温扩增技术检测到细菌而PCR未检测到,此假阳性结果系由于活检中细菌数量极少所致;(2)样本质量亦受多维度限制:咬检组织部位、大小、深度及是否挤压、有效保存固定等[15]。因此,更精准的无创性诊断方法有待开发,样本固定试剂及新的分子生物学技术有待被研究。

1.2胃液

1.2.1胃液的样本检测 胃液也是侵入性样本的一种。胃黏膜的不断更新脱落,使得HP存在于胃液中[16]。在内窥镜下将胃液吸取收集到无菌容器后,储存在4℃的冰箱中行PCR检测[17]。Hsieh等[17]针对根除后复查患者,进行了胃液PCR与细菌培养的对比研究,结果发现胃液PCR的诊断准确性高于细菌培养(96.7% vs 91.3%,P<0.0001),可见,对于根除后复查的患者采用PCR检测可减少细菌培养假阴性造成的漏诊。

1.2.2胃液样本的优势与劣势 胃液样本的PCR检测,具有如下优点:(1)不受胃内HP分布不均的影响,常规方法如组织病理学、快速尿素酶试验在体液中无法检出HP,而PCR能够在胃液中检测出HP,弥补了胃黏膜活检漏检的可能[18];(2)不需要严苛的设备条件要求:取黏膜培养成本高、耗时长、条件苛刻[19],取胃液不需要活菌和培养的关键运输条件[17];(3)适合部分特殊人群:如ITP或存在其他有出血倾向而不适合胃黏膜活检的患者[20],可选择胃镜检查时留取胃液检测HP。胃液样本拓宽了HP的检测范围。

胃液检测同样存在劣势:经胃液样本检测HP,受其含菌量水平影响较大,有一定的局限性。同时,因样本中混有脱落的胃黏膜上皮、外泌体及其他分子,可能对其检测的准确性造成干扰[15]。李东丹等[21]对儿童胃液进行PCR检测HP,结果显示胃液检测的灵敏度为100%,特异度为0,表明其存在一部分假阳性结果。因此,胃液检测仍不属于主流检测方法,仅作为一种辅助手段,更好的技术有待被开发。

2 非侵入性样本

分子生物学HP检测的非侵入性样本主要包括:唾液、牙菌斑及粪便等。因其具有易于收集、无创性特点,患者接受度高,更适用于儿童和老人[22]。有研究表明口腔感染HP可引起干槽症、口腔癌等,粪便HP虽不会引起严重的消化道内外疾病,但是是粪-口传播的重要缘由[23]。因此,有效检测并根除具有重要意义。

2.1唾液

2.1.1唾液的样本检测 口腔感染者的HP带菌唾液可能是造成上消化道感染及细菌粪-口传播的重要媒介之一[23]。食管反流或呕吐可造成HP随胃液到达口腔,故提取这类患者唾液样本可能检测出HP[24]。取样方法为在采集唾液样本前1h不允许清洁牙齿或进食,用无菌棉卷收集大约2～3mL未受刺激的唾液于试管中[24]。Sayed等[25]研究表明唾液PCR检测的敏感性为85%,特异性为70%,高于传统方法,该方法在检测HP口腔感染及传播风险方面具有重要价值。

2.1.2唾液样本的优势及劣势 通过PCR法检查唾液样本,具有如下优势:(1)患者接受度高:唾液取样简便、无痛、无损伤,为无法行胃镜取样的老人、儿童及孕妇等提供了一种新方式[26];(2)药物应用影响较小:基因检测不受临床治疗用药的干扰,检测结果不受近期是否服用过抗生素、质子泵抑制剂等药物的影响[25]。

其劣势也较为明显,因口腔环境复杂,大量的微生物可代谢产生多种物质,当唾液与口腔接触时,唾液中的成分可能会发生改变[27],因此大量的混杂物质可能影响唾液HP检测。Bonamico等[22]研究表明,基于唾液样本中寻找细菌DNA,特异性高(99.1%),但是敏感性差(22.2%)。因此,广泛使用唾液作为检测样本,尚有许多技术上的障碍需要克服。

2.2牙菌斑

2.2.1牙菌斑的样本检测 牙菌斑样本的获取是一种常见的非侵入手段。牙菌斑内细菌发酵产酸使牙周袋内pH较低且乏氧,适宜HP的生长,因此被认为是口腔内HP最可能生存的地方[28]。口腔检查时,通过无菌刮匙在牙周袋附近收集菌斑[29]。Ismail等[30]通过49例患者研究发现PCR在牙菌斑中HP检出率为40.8%,高于胃黏膜组织病理学(36.7%),证实了牙菌斑检测的可行性。

2.2.2牙菌斑样本的优势与劣势 检测牙菌斑样本,具有如下优点:(1)证实复发风险:通过抗HP治疗后胃黏膜中细菌被根除,但可在牙菌斑中检出,很大程度上证实口腔中的HP与消化道疾病的复发存在密切关系[31]。根治胃内HP的同时,治疗口腔内HP有利于减少胃内HP相关疾病复发;(2)受唾液及药物等化学影响小:Verónica等[32]研究171名儿童的唾液和牙菌斑样本表明,同时留取唾液和牙菌斑样本,唾液HP阴性者牙菌斑样本可能阳性,且HP可在牙菌斑中长期生存,阳性率较高。

其劣势与唾液样本类似,同时处于口腔复杂的微生物环境中,口腔中的成分发生改变,同样会影响牙菌斑的检测结果,造成漏诊[29]。广泛使用牙菌斑作为诊断样本,同样有许多技术上的障碍需要克服。舌背、牙齿表面生物膜也应作为样本选择。口腔HP感染者应密切注意刷牙方式及牙膏选择,定期清洁牙结石十分必要[33]。

2.3粪便

2.3.1粪便的样本检测 粪便样本可用于检测HP感染已达成共识[34]。有证据表明胃黏膜上皮约3d完全更新一次,感染者会在粪便中排出HP[35]。取新鲜粪便无需停药,收集的粪便样本在使用前储存在-20℃环境中[34]。Fatemeh等[37]研究显示粪便23SrRNA基因的PCR检测是检测HP感染最有效的方法,粪便样本PCR检测HP的灵敏度为71%,特异度为96%,诊断优势比为65.6。可见,PCR检测粪便中的HP基因是一种很有前途的检测方法[38]。

2.3.2粪便样本的优势与劣势 基于粪便样本的分子生物学检测有以下优势:(1)取材安全无创:粪便取样不需要行胃镜或抽血等侵入性操作,对于配合欠佳人员如儿童具有明显优势[36];(2)优于粪便培养:因粪便中含大量微生物,培养并分离HP难度较大,阳性率较低[39];(3)优于粪便抗原检测:因粪便中HP抗原受HP根除药物及消化道出血影响而发生分解,PCR检测避免了抗原不稳定,诊断效能优于粪便抗原检测[40]。

粪便样本同样存在如下不足:(1)受细菌浓度影响:徐华等[40]研究表明,当HP相对丰度极低时,会抑制PCR反应,影响粪便HP基因检测;(2)受取样位置影响:粪便内HP呈现斑片状分布,因此随机分布可能造成取样部位假阴性结果[41];(3)受储存条件影响:对于门诊患者,不能及时将样本送往医院检测,样本中HP可能在体外有氧环境中降解,会使诊断产生假性结果[42];(4)可检测到基因碎片:PCR检测出的HP的DNA可能为死亡细菌的基因碎片,此类死亡细胞没有致病性,可出现假阳性结果[14]。

3 环境样本

现有已知HP的传播途径有口-口、粪-口传播,其中粪-口传播即是通过HP污染的环境媒介传播。已有研究表明环境中存在HP分布,识别出被HP污染的水源或食物,对切断传播途径尤为重要。

3.1环境样本中HP分布情况 环境样本的分子生物学检测主要用于HP传染源及传染途径的流行病学筛查[43]。有文献报道,HP可在各种水生环境中被检测出,包括饮用水、地表水、海水及废水[44]。Monno等[45]研究表明,食用生的软体动物和贻贝与HP感染显著相关(P=0.0108、0.0067)。可见,HP可能存在于即食食品中,食用这类食品可能造成人类感染HP[46]。因此,水源和食物既是HP的存活场所,也是HP感染粪口传播的媒介[47]。

3.2环境样本检测的意义 环境样本检测HP有以下好处:(1)切断传播途径,通过环境检测,可以找到HP传播链,以从源头上预防HP感染[13]。(2)优于细菌培养,相较于水源的细菌培养,PCR所需的条件要求更低[44]。(3)较高的灵敏度,低密度的细菌也可检测出HP[48]。(4)可检测环境中非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态HP,目前这种变形后的球形HP已通过PCR技术于水体环境及生物媒介中检测出来;同时,研究发现HP可在生的食品中进入VBNC状态[4,49]。

及时发现HP污染源,对细菌传播及HP感染的预防起到重要作用。通过对具有抗生素耐药性的环境HP菌株进行基因分型,并将其与临床样本进行比对,有助于明确传播途径并进行环境净化[43]。

4 总结与展望

HP感染是全球卫生问题,目前我国HP感染人口呈逐年上升趋势。综合多种样本准确、快速地检出HP对相关疾病的早期预防、正确治疗和复发预防具有重要的意义。通常认为新鲜胃黏膜组织标本为检测HP的最佳样本;唾液和牙菌斑是常用的口腔PCR检测标本;感染者体内的HP会随粪便排出,检测粪便同样可获得细菌感染信息;环境样本中HP的检测是明确并切断HP传播途径的有效手段。在阳性率方面,侵入性样本虽高于非侵入性样本,但取材有创,患者接受度较低;在用途方面,环境样本有切断传播途径的意义,更适用于环境样本的基因特异性引物有待研究。因此,研究者应基于不同检测目的及各种样本的优劣势,进行人体及环境HP检测样本的合理选择,以保证HP的合理检测。