p16、p53、PTEN、ER及PR在子宫内膜癌中的表达及其临床意义研究

杨丹 陈燕 郝洋 王艳敏 樊玥 李俊 李晓琦

华北理工大学附属医院妇产科 河北唐山 063000

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是一组以上皮细胞为来源的子宫恶性肿瘤,是女性生殖系统三大恶性肿瘤中的一种,其在发达国家最为常见,在我国位居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位[1]。疾病发生转移或者复发后的治疗较为棘手,严重地影响了患者的预后。近年来部分学者开始广泛研究EC的分子分型,以期为临床诊疗提供新的科学思路[2-3]。

p16、p53、磷酸酶和张力素同源物(PTEN)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)作为肿瘤分子标志物,在国内外文献中多见报道,但有关于其与EC分子分型及指导临床治疗方面的研究较少[4-6]。

本研究旨在探讨上述5种指标与EC的相关性,为EC患者复发风险分层提供新思路,探求具有参考价值的潜在性预后指标[7],从而为选择后续提供思路[8]。

1 对象与方法

1.1研究对象 以2016 年 1 月～ 2021 年 6 月就诊于华北理工大学附属医院妇科并接受手术治疗的EC患者作为研究对象。收集其一般资料及临床病理资料进行回顾性分析。所有EC标本的病理诊断均已经术后病理石蜡切片复核证实。本研究符合华北理工大学附属医院伦理委员会的要求,并得以批准。

1.2纳入标准 (1)均经术后病理检测确诊;(2)研究对象无全身性疾病或局部感染性、免疫性疾病;(3)所有患者术前均未接受任何治疗并且为初次手术治疗;(4)临床资料相对完善者。

1.3排除标准 (1)起源于全身各组织器官除EC外的恶性肿瘤;(2)临床资料及病理资料缺失者。

1.4方法

1.4.1资料收集 检索华北理工大学附属医院病案科电子病历系统筛选符合条件的病例,并摘录住院号、姓名、年龄、身高、体质量、既往史、月经史、生育史等一般资料以及病理资料。

1.4.2检测方法

1.4.2.1蜡块处理 (1)切片:将蜡块组织固定在轮转切片机上,用刀片修整蜡块,将其修成方形且保证每一个切出的蜡片都含有一块组织。然后调整切片机,进行完整均匀切片,每张厚度约4μm,将切片放入35～40°恒温水浴中展平。1张用来HE染色,其余,将切出的呈卷状的蜡片置于摊片机上将其展平。 (2)粘片和烤片:将切片用由多聚赖氨酸防脱处理后的磨沙玻片捞起,然后将载有组织的载玻片固定于烘片机上,调节烘片机温度在60℃,烤片2h,置于干燥处备用,这样可使切片粘附紧密。

1.4.2.2免疫组织化学染色 (1)脱蜡和水化:将切片依次置入纯二甲苯Ⅰ溶液15min、纯二甲苯Ⅱ溶液15min、纯二甲苯Ⅲ溶液15min,使石蜡完全溶解,然后依次放入100%、100%、95%、95%乙醇溶液中各5min、85%、80%乙醇溶液各3min、最后放入自来水、蒸馏水分别冲洗3次,时间各为3min。 (2)抗原修复:向高压锅中加入配置好的pH 8.0EDTA修复液,经高压煮沸后,将切片完全浸入修复液中,继续加热2min,待修复液温度降至室温时,取出切片,室温冷却15min后放入蒸馏水和PBS缓冲液中分别冲洗3遍。然后于切片上滴加3%H2O2去离子水,对切片进行封闭,室温下放置10min。(3)抗体杂交: 孵一抗:用滤纸吸干切片上多余的PBS缓冲液,用铅笔划线圈出标本,并标记内容,将稀释好的一抗溶液分别滴加于切片表面,阴性对照切片表面滴加PBS液,然后将切片置于湿化盒中,湿化盒置于4℃左右冰箱中,孵育过夜。次日,切片置于恒温干燥箱中,维持温度在37℃左右,孵育30min,然后在PBS缓冲液中左右轻轻摆动清洗5min,倒掉PBS缓冲液,重复清洗3次。孵二抗:用滤纸吸干切片上多余的PBS缓冲液,将稀释好的二抗溶液(浓度同一抗)滴加于切片表面,切片置于湿化盒内,将湿化盒置于恒温干燥箱中,维持温度在37℃左右,孵育40min,从恒温干燥箱中取出切片,然后将切片在PBS缓冲液中左右轻轻摆动清洗5min,倒掉PBS缓冲液,重复清洗3次。 (4)显色:将适量配好的DAB显色剂滴于组织上(根据组织块大小调整用量,尽量覆盖全部组织),静置约5min,具体染色的时间根据显色效果而定,当反应部位出现黄褐色时即可终止染色,将切片置于自来水下冲洗。 (5)复染:在苏木素溶液中复染10min,自来水下冲洗。然后用1%盐酸乙醇分化液洗去多余的染液,进行分化,自来水再次冲洗,当切片变为蓝色时停止冲洗。 (6)脱水和透明:切片依次放入60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液各2min、100%、100%乙醇溶液各5min完成脱水过程,然后再浸泡于纯二甲苯Ⅰ溶液15min、纯二甲苯Ⅱ溶液15min,至透明为止。 (7)封片:向组织中央滴中性树胶,将组织全部覆盖,加盖盖玻片。 (8)观察:电子显微镜下观察每个切片的染色情况,采集图片,对每个切片的表达情况进行评分,分析结果。

1.5分子标志物的结果判定 p16、p53、PTEN、ER、PR阳性信号定位于细胞核。随机选择高倍视野10个,在每单个高倍镜视野中随机选取100个细胞进行检测,按阳性细胞数在每高倍视野中所占百分比进行计数,评估则应用免疫反应积分法(IRS):IRS=阳性细胞的染色程度×阳性细胞所占百分比[9]。将阳性细胞的染色程度分为4个不同的等级: 无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3 分。将全片阳性细胞所占的总百分比分为5个等级:阳性细胞数<5%为0分,5%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。因此,IRS的值0～12,<1分即为阴性,1～12分为阳性。

2 结果

2.1临床资料特点 本研究共113例,年龄25～80岁,中位年龄57岁,其中74例(65.4%)为绝经后女性。合并高血压40例,合并糖尿病23例,合并冠心病8例。所有的患者在手术前均未接受放、化疗。104例(92.0%)为Ⅰ型EC(均为内膜样癌),9例(8.0%)为Ⅱ型EC(高级别浆液性癌3例、透明细胞癌2例、低级别子宫内膜间质肉瘤2例、癌肉瘤1例、子宫内膜黏液性腺癌1例)。I型患者平均发病年龄(57.05±10.05)岁,II型患者(59.33±9.38)岁,其发病年龄差异无统计学意义(P=0.261);I型、II型EC患者BMI差异有统计学意义(P=0.007)。见表1。

表1 113例EC患者基线和人口特征线 [例(%)]

2.2p16、p53、PTEN、ER、PR在EC中的表达

2.2.1p16表达 p16在Ⅰ型、Ⅱ型EC中均有阳性表达,见图1A,其在Ⅱ型中的表达高于Ⅰ型,差异具有统计学意义(P<0.05)。p16在Ⅰ型EC中的表达多为部分表达、局灶表达,而在浆液性癌、透明细胞癌、癌肉瘤中呈强阳性表达。本研究中9例Ⅱ型EC中有8例呈强阳性表达。结果表明,p16的表达在EC是否有淋巴结转移中的差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ型EC中p16的表达在不同分化程度、不同浸润子宫肌层程度、是否浸润脉管、不同临床-病理分期差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图1 p16、p53、ER和PR蛋白在子宫内膜癌中的表达

表2 子宫内膜疾病中五种标志物的表达 [例(%)]

2.2.2p53表达 p53蛋白在Ⅱ型EC中的表达情况明显多于Ⅰ型EC,见图1B,差异具有统计学意义(P<0.05)。p53在不同分化程度的Ⅰ型EC、不同浸润子宫肌层程度、是否淋巴结转移、是否浸润脉管、不同的临床-病理分期中的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2.3PTEN表达 PTEN在Ⅰ型EC表达率高于Ⅱ型EC,但差异无统计学意义(P>0.05)。PTEN表达在不同浸润子宫肌层程度、是否脉管浸润、是否淋巴结转移中差异有统计学意义(P<0.05),在Ⅰ型EC分级、不同临床病理分期等组间分布未发现不同,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2.4ER、PR表达 ER、PR在Ⅰ型EC中的表达率高于Ⅱ型,见图1C、D,差异具有统计学意义(P<0.05)。ER、PR在Ⅰ型EC的病理分级、不同临床病理分期、是否浸润脉管及淋巴结有无转移中的表达差异均具有统计学意义(P<0.05)。ER在不同浸润子宫肌层程度中表达差异无统计意义(P>0.05),而PR的表达则差异有统计意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

EC也叫子宫体癌,是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,从分子生物学的角度,EC的发病机制包括三方面:第一,基因失活的渐变;第二,抑癌基因突变;第三,癌基因的激活[10]。

p16作为宫颈病变的重要分子标志物,在子宫颈的病变中通常呈弥漫性阳性表达,在宫颈癌与EC的鉴别中常应用此标志物进行诊断。有研究表明,在EC中也可检测到p16的表达,但是不同类型的EC中p16的表达率、表达强度以及表达范围略有不同,其具体机制尚不清楚[11]。本研究中在Ⅱ型EC中p16的表达率为88.89%(8/9),且为弥漫强阳性;在Ⅰ型EC中表达率为39.4%(41/104),且多为弱阳性表达,二者有一定区别。因此可推断出p16在Ⅰ型EC与其他类型EC之间的鉴别诊断中具有一定的指导意义。

p53是一种肿瘤抑癌基因,p53蛋白作为细胞转录因子,通过抑制细胞复制、启动细胞凋亡程序从而保持基因组的相对稳定,使细胞能够保持正常生长,从而抑制细胞往恶性方向增殖[11]。p53蛋白分为两种不同的亚型:野生型、突变型。野生型p53蛋白因半衰期稍短而不易被检测出;突变型的p53蛋白半衰期相对较长,免疫组化方法便于检出,可提示p53蛋白处于基因突变状态,而p53是诱发Ⅱ型EC的重要因素之一[12]。本研究中基因突变型p53蛋白在Ⅰ型和Ⅱ型EC中表达比例不同。研究表明Ⅰ型EC中p53蛋白的表达呈节段式弱阳性,而在Ⅱ型EC中的表达则呈弥漫强阳性[13],此现象可能与野生型p53的聚集相关,从而证明了p53在EC的分子分型中具有不可忽视的重要应用价值。本研究中在不同分化程度的Ⅰ型EC中、脉管浸润与否、子宫肌层浸润程度、不同的临床分期中p53的表达差异均有统计学意义(P<0.05),从而证明了p53在促进肿瘤的发生发展过程中起到重要作用,且进一步证实了在众多反映EC生物学行为的辅助指标中,p53尤为重要,进而可评估肿瘤的不同分化程度及EC患者的预后情况,对指导临床诊疗具有重要参考意义。

PTEN也是一种重要的肿瘤抑制基因,维持正常细胞功能。近年来有研究表明,其在EC、黑色素瘤、前列腺癌等肿瘤中具有重要作用[13]。采用免疫组化方法检测PTEN蛋白,能将由不同机制导致的PTEN失活体现出来[14]。本研究中PTEN在子宫内膜癌中的阳性表达率为 42.4%(48/113),其中Ⅰ型EC的阳性表达率为44.2%(46/104),Ⅱ型EC的阳性表达率为22.2%(2/9),Ⅰ型明显高于Ⅱ型。从而证明在EC的发生发展中PTEN失活起了一定的激化作用,而其在Ⅰ型EC中尤为明显。进一步推测PTEN的表达情况对于EC分型有一定的辅助意义。

有研究表明,ER和PR的阳性表达在降低细胞恶性程度、降低肿瘤侵袭性及抑制EC转化向非激素依赖型肿瘤方面等有不同程度的作用,伴随着病理分级从低级别到高级别、手术分期从Ⅰ期到Ⅱ期以及肿瘤肌层浸润深度从浅入深[15-16],ER、PR在EC中的表达量分别有不同程度的下降(P<0.05)。有研究表明ER、PR在EC中的阳性表达程度越高,EC患者的有效生存期越长,预后则越好[17]。因此,检测ER、PR在EC中的表达对预后及临床诊疗等具有重要参考意义。

关于EC相关分子标志物在EC中的表达国内外文献很普遍[18],但对于上述5种分子标志物各自表达的研究并不多。本研究认为p16、p53、PTEN、ER和PR蛋白的表达在临床判断EC的分子分型方面提供了新思路,实际工作中可联合使用指导临床诊疗,为分子分型提供科学依据[19-20]。许多疾病的发生发展,特别是肿瘤多与基因突变有关;在日常工作中正确合理的检测肿瘤组织中此类基因蛋白的表达,可以为临床医生关于子宫内膜癌的诊治思路提供指导,从而提高医疗质量[21-23]。