发酵型和配制型山楂酒中主要呈香物质组成分析

谷佩珊，陈亦新，王春光，朱雨萱，常晓敏，王思思，朱保庆,，汪厚银,

（1.北京林业大学生物科学与技术学院，林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083；2.中国标准化研究院农业食品标准化研究所，北京 100191）

山楂（Crataegus pinnatifidaBge.）是蔷薇科山楂属植物，在我国山东、山西、辽宁等地都有种植，是我国特有的药食同源林果[1]。山楂果实富含营养，具有开胃健脾、降血压、降血脂、活血化痰等功效[2]。我国山楂产量虽高，但鲜食口感较酸，因此常对其进行加工，而山楂酒因其天然的营养成分和细腻的风味作为最有发展前景的产品之一[3-5]。香气是包括果酒在内的食品感官品质的重要方面[6]，目前关于山楂酒香气的研究较少[7]。

气相色谱-四极杆质谱（gas chromatographyquadrupole-mass spectrometry，GC-Quadrupole-MS）联用法是一种鉴定果汁和果酒香气成分的常用方法，如Lin Yanxin等[8]在6 种沼泽越橘酒中共检测到99 种挥发性成分，92 种挥发性成分的峰面积比在样品间存在显著差异；庞惟俏等[9]对大兴安岭野生蓝莓果酒及果汁进行分析，分别鉴定出45 种和28 种挥发性成分。气相色谱-静电场轨道阱质谱（gas chromatography-orbitrap-mass spectrometry，GC-Orbitrap-MS）联用法是一种灵敏度极高的新型GC-MS技术，具有高质量分辨率（120000半峰全宽（m/z200）以及高质量精度（＜3 mg/L））的优势，并已经应用到果酒痕量香气组分定量研究中[10-11]。

气相色谱嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法是一种将嗅觉仪与GC相结合的方法，与MS联用能够更有效地鉴定影响样品中呈香的关键物质。Zhu Jiancai等[12]通过热解吸系统结合GC-MS-O的方式对山楂果泥中的挥发性成分进行研究，并结合香气活性值得到山楂果泥的特征香气化合物。气味活性值（odor active value，OAV）是香气化合物含量与阈值的比值，通常认为单体化合物的OAV超过1则表示该化合物对样品的整体香气有贡献；然而在葡萄酒等样品中，也有学者认为OAV高于0.1的酯类化合物也具有香气贡献[13]。

本研究采用液液萃取-溶剂辅助风味蒸发（liquidliquid extraction-solvent assisted flavor evaporation，LLESAFE）结合GC-O-MS方法对山楂酒的特征香气化合物进行鉴定，并计算量化强度（modified frequency，MF）值；采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction extraction，HS-SPME）对山楂酒中的挥发性成分进行提取，分别采用GC-Quadrupole-MS和GCOrbitrap-MS进行定性和定量分析，并计算化合物的OAV确定其香气贡献。研究山楂酒的呈香物质，对开发出品质优良、风味纯正的山楂酒产品具有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵型山楂酒（SBL-J）于2020年6月来自山东皇尊庄园山楂酒有限公司，乙醇体积分数为13%；配制型山楂酒（FS）来自北京丰收葡萄酒有限公司，乙醇体积分数为14%。

发酵型山楂酒（SBL-J）配料：敞口山楂汁、焦亚硫酸钾。

配制型山楂酒（FS）配料：山楂、纯净水、食用酒精、白砂糖、红葡萄酒、食用添加剂（柠檬酸、山梨酸钾、焦亚硫酸钾）。

甲醇、乙醇、二氯甲烷（均为色谱纯）美国Honeywell公司；香气标准品（色谱纯）、C7～C40正构烷烃标准品、4-甲基-2-戊醇（内标）美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

嗅觉仪（olfactory detection port，ODP）瑞士Brechbühler公司；SAFE装置 德国Glasbläserei Bahr公司；DC-12 型氮吹仪 上海安谱科学仪器有限公司；7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Aglient科技有限公司；Trace 1300气相色谱仪、Q-exact Orbitrap质谱仪 美国Thermo Scientific公司；DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美国J&W Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 感官分析

采用定量描述性分析方法，评价小组由15 名评价员组成。要求评价员嗅闻酒样的香气，并对讨论得出的11 种香气属性进行强度打分，分别为山楂香、果香、甜香、蜂蜜香、酒精味、酱香、啤酒、甘草、烟熏、中药香、花香。打分采用10 点标度法（0～9 分，0 分代表感受不到香气，9 分代表香气十分强烈）。

1.3.2 GC-O嗅闻分析

LLE：取样品各100 mL，分别用50、30 mL和30 mL二氯甲烷进行3 次萃取，每次通过磁力搅拌（700 r/min）10 min。采用分液漏斗合并有机相，得到山楂酒香气提取液。

SAFE：循环水浴及恒温水槽温度均设置为50 ℃，开启分子涡轮泵，系统真空度达到1×10-6MPa时打开滴液漏斗旋塞，使其缓慢滴入圆底蒸馏瓶中。SAFE装置收集瓶中提取液在室温下自然融化后，加入10 g无水硫酸钠干燥，4 ℃冰箱静置12 h后过滤，有机相通过氮吹浓缩至500 μL，获得挥发性成分浓缩液。

GC条件：1）HP-INNOWAX极性色谱柱（60 m× 0.25 mm，0.25 μm）；载气（He）流速1.5 mL/min；进样量1 μL；不分流；升温程序：进样口温度250 ℃，在柱温50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。2）HP-5MS非极性色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气（He）流速1 m L/min；进样量1 μL；不分流；升温程序：进样口温度250 ℃，柱温40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至180 ℃，以9 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

MS条件：接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子电离源；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z30～550。

ODP条件：样品经色谱柱分离后1∶1分别进入质谱和ODP进行检测；嗅闻口温度220 ℃；湿润的空气以 50 mL/min流入嗅闻口。

选取4 名（3 女1 男，22～24 岁）有嗅闻经验的评价员组成评价小组。实验前，对4 位评价员展开香气识别记忆训练，通过将49 种单体标准品配制成浓度超阈值3 倍及以上的香气瓶[14]进行香气识别和记忆。实验时，4 名评价员记录香气化合物从嗅探口感受到流出物开始和结束的时间，并记录香气特征和强度，强度用“1～11”进行打分。

定性分析：香气物质的定性通过将该组分的保留指数与香气标准品的保留指数、香气描述、NIST 20标准谱库相匹配确定。

MF计算：强度法与检测频率法结合，每个样品在每个色谱条件下被4 名评价员重复嗅闻2 次，依据每个化合物被评价的香气强度和频率计算MF[15-16]。按下式计算：

式中：F为某一化合物被嗅闻到的总频数/嗅闻总次数，取值为百分数；I为小组成员对某一化合物评价的香气强度之和/（最高分值×嗅闻次数），取值为百分数。

1.3.3 GC-Quadrupole-MS方法对山楂酒香气物质的定性定量分析

HS-SPME：SPME萃取头采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS，CTC CombiPAL autosampler多功能自动进样器实现自动化顶空固相微萃取。样品瓶在40 ℃以 500 r/min加热30 min。将已活化的萃取头插入到样品瓶顶空中，40 ℃吸附挥发物质30 min。再将萃取头插入GC进样口中，热解吸8 min，进样口温度250 ℃。

GC-MS条件：采用7890-5975 GC-MS联用仪，HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气（＞99.999%）；流速1.0 mL/min；不分流模式；升温程序：初始温度50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升温至220 ℃，保持5 min；接口温度280℃；离子源温度230℃，电子电离源；电离能量70 eV；质量扫描范围30～350 u。

定性定量分析：通过自动化质谱图解卷积和鉴定软件（AMDIS）计算得到保留指数和质谱信息，将质谱分析结果结合NIST 20标准谱库匹配检索。在相同色谱条件下，通过C7～C40正构烷烃混合物获得保留指数。通过内标标准曲线法进行定量分析，有标准品的化合物分别建立标准曲线进行定量，对于没有标准品的化合物，通过其结构类似物进行半定量[17]。

1.3.4 GC-Orbitrap-MS方法对山楂酒香气物质的定性定量分析

HS-SPME条件：采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，采用TriPlus RSH自动进样器。样品在60 ℃加热和搅拌平衡30 min后，60 ℃萃取30 min。将萃取头插入到GC进样口，热解吸8 min，进样口温度250 ℃。

GC-Orbitrap-MS[10]：采用Trace 1300气相色谱仪与Q-exact Orbitrap质谱仪联用分析。DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（＞99.999%）；流速1.0 mL/min；不分流模式；升温程序：在40 ℃保持5 min，以3 ℃/min升温至180 ℃，再以3 ℃/min 升温至250 ℃，保持10 min；总运行时间64 min。电离能70 eV；质量扫描范围33～300 u。

定性定量分析：在相同色谱条件下，通过C7～C40正构烷烃混合物获得保留指数。通过匹配香气物质中的保留时间和离子碎片，与本研究小组建立的香气化合物检索数据库[18]（Food Flavor Laboratory,http://foodflavorlab.cn/）对比进行定性。使用TraceFinder软件（Thermo Fisher Scientific,Les Ulis,France）进行解卷积，采用Xcalibur 4.1版（Thermo Fisher Scientific,Les Ulis,France）进行化合物定量分析。

1.3.5 OAV计算

化合物含量与阈值的比值即为OAV。本研究认为OAV大于0.1的酯类化合物和OAV大于1的其他类化合物对山楂酒整体香气具有一定贡献[13]。

1.4 数据处理

采用https://hiplot-academic.com/basic网站绘制Venn图，其余实验数据分析及图表绘制均使用Microsoft Office Excel 2019软件。

2 结果与分析

2.1 感官分析结果

对于2 款山楂酒样品进行定量描述性分析，根 据图1可以看出发酵型山楂酒SBL-J和配制型山楂酒FS在山楂香和酒精味两个属性具有相似的强度。相比而言，SBL-J样品具有更强的果香，同时具有一些独特啤酒的香气；而FS样品具有较强的甜香和蜂蜜味，同时具有一些独特的花香、甘草、烟熏和中药味，增加了酒体香气的复杂度。

图1 山楂酒香气雷达图Fig.1 Radar chart of hawthorn wine aroma

2.2 GC-O-MS结果

经过GC-O-MS分析，共鉴定到89 种化合物，包括酯类36 种、醇类15 种、萜烯类2 种、酸类12 种、醛类3 种、酮类5 种、苯环类2 种、呋喃类4 种、挥发性酚类3 种、吡喃酮类2 种、硫化物1 种、内酯类化合物4 种（表1和图2）。酯类化合物在两款样品中均为鉴定到数量最多的物质，可以赋予果酒浓郁的果香[19]；其次是醇类和酸类，而苯环类物质和吡喃酮类物质仅在SBL-J中被鉴定到。

表1 利用LLE-SAFE-GC-O鉴定山楂酒中香气活性化合物Table 1 Odor-active compounds identified in hawthorn wine by LLE-SAFE-GC-O

图2 利用LLE-SAFE-GC-O鉴定山楂酒中各类香气物质种类数量Fig.2 Number of aroma compounds identified in hawthorn wine by LLE-SAFE-GC-O

根据表1和图3，SBL-J样品共鉴定到65 种香气物质，在HP-5MS和HP-INNOWAX色谱柱中分别鉴定到了31 种和48 种，两种色谱柱鉴定出的物质中有14 种保持一致；FS样品共鉴定到58 种香气物质，在HP-5MS和 HP-INNOWAX色谱柱中分别鉴定到了28 种和42 种，两种色谱柱鉴定出的物质中有12 种保持一致。根据表1，使用HP-INNOWAX色谱柱和HP-5MS色谱柱在2 种山楂酒样品鉴定到的化合物有所区别，相比而言，HP-INNOWAX色谱柱在2 种山楂酒中均鉴定出更多的酯类、醇类、酸类、酮类化合物，因此认为，HP-INNOWAX色谱柱对山楂酒样品挥发性物质的检测效果比HP-5MS色谱柱效果更佳，可以检测到更多的物质。

图3 不同色谱柱鉴定到的化合物Venn图Fig.3 Venn diagram of compounds identified using different chromatographic columns

SBL-J中有29 种香气化合物的MF值大于20%，由HP-5MS和HP-INNOWAX色谱柱各鉴定出12 种和24 种；其中苯乙醇具有最大的MF值（87.26%），被描述为花香、甜香味；其次是乙酸异戊酯（74.62%），被描述为香蕉、果香味。FS中有38 种香气化合物的MF值大于20%，由HP-5MS和HP-INNOWAX色谱柱分别分离出17 种和27 种；其中MF值最高的是苹果酸二乙酯（68.36%），被描述为甜香、山楂和绿色；其次是顺式-3-己烯-1-醇（66.89%）和2,4-己二烯酸（66.89%），分别被描述为甜香、青草味及山楂、花香味。在SBL-J样品中有更多的物质被嗅闻并描述为果香，包括一些酯类如异丁酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯，这些酯类仅出现在SBL-J样品中，同时具有较高的MF值，对样品的整体香气有一定贡献，是感官分析结果中SBL-J样品具有更强果香的原因之一。FS样品中被嗅闻到的中药味可能与MF值较高的(E,E)-2,4-己二烯酸乙酯和4-乙基苯酚有关，这两种物质都被描述为中药味，并且在FS样品中的MF值高于SBL-J样品。

有16 种化合物在2 种样品中的MF值均大于20%，包含酯类6 种、醇类5 种、酸类2 种以及呋喃类、硫化物类、内酯类各1 种，且大部分被描述为果香、甜香、蜂蜜。2-甲基丁酸乙酯（果香、奶油、甜香味）、苯乙醇（花香、甜香味）、3-甲硫基丙醇（粗粮、蒸煮、植物味）、5-甲基-3-亚甲二氢-2(3H)-呋喃酮（花香、果香、奶油味）、乙酸（醋味）、异戊醇（油脂、果香、溶剂味）、γ-羧乙氧基-γ-丁内酯（蜂蜜、甜香、果香味）、丁二酸二乙酯（臭味、芝士味）等化合物的MF值较高，对于山楂酒香气有重要贡献。化合物呈香可能受浓度的影响[20]，如乙酸乙酯在一定浓度下表现为果香味，浓度过高时则为指甲油味。丁二酸二乙酯在GC-O过程中被嗅闻到臭味和芝士味，而非相关文献中报告的果香和奶油味[21-22]，可能是由于在样品中浓度过高产生令人不愉悦的异味。

2.3 香气物质的定性定量分析

使用GC-Orbitrap-MS和GC-Quadrupole-MS两种方法对山楂酒进行鉴定，共鉴定到123 种挥发性化合物（表2、图4）；其中107 种在样品间存在显著性差异，推测是不同原料及加工工艺导致[23]。如图4所示，2 种样品中醇类、酸类、酯类的含量明显高于其他类别的组分，其中SBL-J中各类挥发性化合物含量为：醇类＞酯类＞酸类＞其他类化合物；FS中各类挥发性化合物含量为：酯类＞酸类＞醇类＞其他类化合物。SBL-J中香气物质含量最高的是异戊醇（150.04 mg/L），其次为苯乙醇（48.83 mg/L）。此外，乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、2,4-己二烯酸、2,3-丁二醇、异丁醇、乙酸、乳酸乙酯的含量均超过了3 mg/L。FS中含量最高的物质为2,4-己二烯酸（64.16 mg/L）和乙酸乙酯（40.55 mg/L），异戊醇、乳酸乙酯、乙酸、丁二酸二乙酯、2,3-丁二醇、苯乙醇的含量也超过了3 mg/L。这与前人研究结果较为一致，张峻松等[24]发现山楂酒主要成分为异戊醇（6.09%）、丁二酸二乙酯（3.26%）；高哲等[7]发现丁二酸乙酯、苯乙醇、丁二酸二乙酯、2,3-丁二醇、乳酸乙酯等化合物为山楂酒主要香气化合物。虽然异戊醇、2,4-己二烯酸、异丁醇等化合物含量较高，但由于其较高的阈值导致OAV均小 于1，对于样品整体香气的贡献较小。

表2 山楂酒中香气物质含量 Table 2 Contents of aroma compounds in hawthorn wine

图4 山楂酒中不同种类挥发性成分相对含量比较Fig.4 Comparison of composition of volatile compounds in two hawthorn wines

2.4 OAV分析及关键香气化合物

表3表明，SBL-J和FS中各有29 种和33 种香气化合物的OAV大于1（酯类OAV大于0.1），其中有27 种物质同时存在于2 种样品中。SBL-J中OAV最高的化合物为苯乙醇（86.54），其次为丙酸乙酯（80.10）和乙酸异戊酯（43.65）；FS中OAV最高的物质为α-松油醇（70.68），其次为丙酸乙酯（56.80）和苯乙醛（46.44）。虽然丙酸乙酯在2 种样品中的含量均较低（11.36～16.02 μg/L），但由于其阈值较低（0.2 μg/L），仍具有较高的OAV，对样品整体香气有重要贡献。苯乙醇在SBL-J中的OAV高于FS，主要是由于苯乙醇属于发酵类香气物质，有研究[54]表明，大部分的醇通过酵母Ehrlich途径产生。SBL-J中乙酸异戊酯的OAV更高，同样是由于乙酸异戊酯主要来源于发酵过程[54]。

表3 山楂酒关键香气化合物的OAVTable 3 OAVs of the key aroma compounds in hawthorn wine

大多OAV较高的挥发性化合物，其MF值同样也较高，两者保持较好的一致性。例如，OAV较高的异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、苯乙醇、正辛酸、苯乙醛、丁香酚等，MF值均在20%以上。SBL-J和FS中各有7 种和9 种香气物质的MF值大于20%且OAV大于1（酯类大于0.1）：SBL-J中为2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯；而FS中为 2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苹果酸二乙酯、苯乙醇、(E,E)-2,4-己二烯酸乙酯、正辛酸、苯乙醛、丁香酚。这些香气物质是山楂酒样品重要的特征风味物质。对比2 种样品存在差异的特征风味物质能够发现，发酵型山楂酒SBL-J的特征风味物质除贡献花香和甜香的苯乙醇外，其余均是贡献果香的酯类化合物，与感官分析结果中SBL-J样品较高的果香得分相对应；配制型山楂酒FS的特征风味物质中(E,E)-2,4-己二烯酸乙酯贡献的中药味以及丁香酚贡献的酱香、香料味是2 种样品感官分析过程中中药味、酱香味产生区别的重要原因。

3 结论

采用定量描述性分析对发酵型和配制型山楂酒进行感官分析，并采用LLE-SAFE方法对发酵型和配制型山楂酒中挥发性组分富集提取，通过GC-O-MS在两样品中分别鉴定到65 种和58 种。发酵型山楂酒SBL-J中MF值较大的化合物包括苯乙醇、乙酸异戊酯；配制型山楂酒FS中包括苹果酸二乙酯、顺式-3-己烯-1-醇、2,4-己二烯酸等。通过GC-Orbitrap-MS和GC-Quadrupole-MS两种方法进行香气组分的定性和定量，共鉴定到123 种挥发性化合物。结合MF值与OAV分析发现SBL-J和FS中各有7 种和9 种香气成分的MF值大于20%且OAV大于1（酯类大于0.1），这些香气成分是山楂酒的重要呈香物质。本研究结果有助于山楂酒香气深入解析和定向调控等工作 的开展。