健康产蛋母鸭蛋内容物非致病菌与其生殖道和盲肠菌群的相关性分析

卢昌丽，熊香元，陈力力，任佑华，刘 焱，张仁杰

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.清镇市站街镇农村发展综合服务中心，贵州 贵阳 551403；3.湖南文理学院，湖南 常德 415000）

鸭蛋是我国消费者餐桌上除鸡蛋外常见的禽蛋，2020年我国鸭蛋产量高达284.66万 t[1]，鸭蛋不仅可以鲜食，还能加工成咸鸭蛋、皮蛋、糟蛋等蛋制品。消费者对它的需求量也在逐年递增，因此鲜鸭蛋的质量与卫生对消费者的食用安全影响广泛。鲜鸭蛋营养丰富也是细菌生长繁殖的良好基质，易受细菌污染而导致保质期短，甚至失去食用价值，一般认为刚产出的禽蛋表面天然保护膜对微生物侵染有一定自卫能力，蛋内容物细菌污染的主要原因在于鸭舍类型、饲养方式、管理模式及气候条件等环境因素造成细菌生长繁殖，这些环境污染细菌通过鸭蛋壳气孔渗透进入蛋内即水平传播污染[2]；然而，鸭蛋形成的复杂过程也可能是造成蛋内容物细菌污染的原因，尤其是散养或圈养的蛋鸭很难做到集约化管理，自然环境因素使得母鸭体内有大量定植的微生物菌群，在鸭蛋形成过程中产生影响，但是目前人们仅开展了母禽体内致病菌或兽药残留对禽蛋影响的研究，例如，研究表明肠炎沙门菌可通过水平传播和垂直传播两种途径污染鸡蛋，并且能够利用其独特的分子调节机制逃避蛋清内抗菌成分的杀伤，表现出比其他血清型更强的蛋内增殖能力[3]。抗生素作为饲料添加剂饲喂产蛋母鸡时，不仅促使母禽体内细菌产生耐药性，而且在某一时期可从母体和鸡蛋内或鸡蛋形成的各个阶段均检测到抗生素残留[4]。对于健康产蛋母鸭是否能通过垂直传播方式使非致病菌侵染蛋内容物，从而对蛋品质产生潜在影响鲜见报道。为此，本研究从蛋鸭养殖场随机挑选健康的产蛋母鸭（麻鸭），无菌解剖采集盲肠组织和生殖道组织以及同批软壳和硬壳鸭蛋内容物为样品，比较其可培养菌落总数数量，未培养菌的多样性、功能预测以及相关性，探讨鸭蛋内容物非致病性细菌与母鸭生殖道和盲肠菌群的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从湖南长沙岳麓区兴合村乌泥塘鸭场随机挑选处于健康产蛋期的产蛋母鸭（麻鸭）6 只，鸭龄6 月，体质量（750±50）g，提前1 d分笼饲养。根据GB 14922.2—2011《实验动物 微生物学等级及监测》取样要求，无菌操作打开腹腔取出盲肠、生殖道组织以及体腔内的软壳蛋和排出的硬壳蛋4 组样品，每两只鸭的相同部位为一份，分别装入无菌袋，并编号为盲肠样品MC1、MC2、MC3；生殖道样品SZ1、SZ2、SZ3；软壳蛋样品RD1、RD2和硬壳蛋样品CD1、CD2。随后装入冰盒带回实验室冰箱保存，备用。

Tris-饱和酚（pH＞7.8）、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；蛋白酶K、RNaseA酶、LB肉汤培养基 北京康为世纪生物科技有限公司；氯仿、异戊醇、无水乙醇、Tris-HCl、异丙醇 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BioSpectrometer®basic分光光度计 德国艾本德股份公司；JY600C水平电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；Gel Doc XR＋凝胶成像系统 美国Bio-Rad 公司；Nano Drop 2000 美国Thermo Fisher公司；MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 样品可培养细菌菌落总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》，盲肠（MC1、MC2、MC3）及生殖道（SZ1、SZ2、SZ3）样品剪碎后各称取5 g，软壳蛋（RD1、RD2）和硬壳蛋（CD1、CD2）内容物分别混匀后各称取5 g，随后，分别用无菌生理盐水适当10 倍梯度稀释，取稀释样品悬液混菌法接种至PCA琼脂培养基平板，放置培养箱（37±1）℃恒温培养（36±2）h进行可培养菌菌落计数。

1.3.2 样品未培养细菌MiSeq高通量测序

采用十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠冻融法提取样品细菌基因组DNA，每份样品设定3 个重复，分别编号为MC1-1、MC1-2、MC1-3、SZ1-1、SZ1-2、SZ1-3等。经琼脂糖凝胶电泳观察及NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计检测合格后，采用带有barcode的特异引物进行细菌16S rDNA聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，引物为Primer 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和Primer 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。将PCR扩增产物经胶回收纯化，高通量测序工作由上海美吉生物工程有限公司完成。

1.4 数据整理与统计分析

菌落总数计数采用SPSS 21.0和Origin 2018软件计算数据并绘图。

根据barcode序列区分得到各个样本reads，经过处理得到clean reads。用对应的软件进行细菌可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）和聚类分析得到OTU的代表序列（97%相似水平），并以绘制稀释曲线进行深度验证。随后应用Mothur软件进行α多样性指数分析，通过非度量多维尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析比较群落β多样性，从不同分类水平分析各样品的物种组成。通过PICRUSt功能预测软件分析直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Module以及Pathway不同水平途径的功能信息，并计算各功能信息丰度。此外，使用BugBase工具进行表型预测，并分析各物种的表型贡献度。比较共有菌属在各样品中的丰度占比，利用线性判别分析Effect Size（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）多级物种差异判别分析显著丰度差异特征的物种，Network 网络分析比较各样品中不同细菌物种的相关性，系统进化树分析物种之间的亲缘和进化关系。

2 结果与分析

2.1 样品可培养细菌的菌落总数计数

样品可培养菌落总数计数结果见图1，MC菌落总数最高，其次为SZ和CR、RD。研究报道[5-6]家禽肠道细菌在机体营养物质消化、病原体抑制和与肠道相关免疫系统相互作用方面发挥着重要作用；近年来人们对人类、畜牧以及鸡胚的研究表明[7-8]，早在胚胎时期，胎儿体内已经具有自己的肠道细菌群落，复杂的微生物组可以从母亲肠道向胎儿传播，并且通过显微镜和培养技术得到了验证，因此认为本研究健康母鸭体内软壳蛋（卵子）内的活菌与其盲肠细菌是有关联的。由于微生物对人类健康和生育有一定的影响，生殖道细菌及群落也成为了关注的焦点[9]。家禽病理学研究报道致病性大肠杆菌、鸡新城疫病毒引起的输卵管炎，导致蛋鸡产蛋量下降及聚集性死亡[10-11]；在鸡蛋形成的各个阶段中，都有可能产生兽药残留[12]；因此，生殖道的定居细菌进入蛋内可能发生。

2.2 样品测序丰度及多样性

采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测及OD260nm/OD280nm比值测定，表明各样品细菌基因组DNA及PCR扩增产物的浓度和纯度均符合要求。4 组30 个样本共得到优化序列1411296 条，在97%相似度下聚类共产生4239 个OTU。其中，MC有效序列、OTU数为448977、634 个，SZ 398383、806 个，RD 283291、2636 个，CD 280645、2293 个。由图2a可知，所有曲线逐渐平滑直至达到平坦，最终数据量已经足以覆盖样品中的大多数细菌序列，本实验结果能够进行下一步数据分析。图2b表明，各组样品的细菌多样性存在显著差异（P＜0.05），Shannon指数多样性大小为CD＜ RD＜SZ＜MC。图2c比较了4 组样品的β多样性，4 组样品各点聚集在一定的区域，SZ组比较分散，说明SZ组内样品细菌组成结构存在一定差异。MC和SZ置信椭圆有相交，RD和CD置信椭圆重叠，其细菌组成结构特征都相似，硬壳蛋是提前1 d装笼的母鸭所产，排出时间不超过16 h，所受外界环境污染较小，因此其来源与软壳蛋相似，其细菌组成以鸭蛋形成过程中的细菌侵染为主。

图2 样品序列数据的多样性分析Fig.2 Diversity analysis of sequence data in samples

2.3 样品物种组成分析

基于OTU注释结果，4 组共30 个样品的细菌分属于56 个门，从图3a可知，门水平优势物种主要有厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）、放线菌门（Actinobacteriota）以及脱硫杆菌门（Desulfobacterota），其中厚壁菌门中SZ和MC组相对丰度大，分别为（17.33±2.36）%、（14.33±2.35）%；变形菌门中RD与CD的相对丰度占比较大，分别为（23.01±0.92）%和（22.5±0.50）%；拟杆菌门为第三优势菌，在SZ、MC、RD及CD组中相对丰度分别为（9.27±3.35）%、（19.33±3.69）%、（3.40±0.21）%和（3.85±0.05）%。本研究中MC及SZ组物种主要属于厚壁菌门，分别与杨速等[13]研究蛋鸭盲肠细菌组成以及Su Yuan等[14]研究蛋鸡生殖道微生物菌群的结果相似。RD及CD组物种主要属于变形菌门，这与丁金梅[15]研究结果相似。

图3 样品不同水平物种组成分析Fig.3 Analysis of bacterial species composition in samples

在检测到的1319 个细菌属中，厚壁菌门270 个属、变形菌门316 个属、拟杆菌门146 个属。如图3b所示，优势菌属有拟杆菌属（Bacteroides）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、巨单胞菌属（Megamonas）、弯曲杆菌属（Campylobacter）以及丛毛单胞菌属（Comamonas）等。虽然α多样性分析表明RD、CD种群多样性大于MC、SZ，但相对丰度值排在前48 位的属水平物种中，MC、SZ均匀度更好。MC中的巨单胞菌属为一类化能有机营养型细菌，能发酵各种碳水化合物形成终产物乙酸、丙酸和乳酸等；考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）为专性厌氧和革兰氏阴性的肠道有益细菌，可利用琥珀酸，产生短链脂肪酸（乙酸盐和丙酸盐）；革兰氏阳性厌氧菌扭链瘤胃球菌属（Ruminococcus torquesgroup）为消化降解的关键菌，曾被报道为孵化机孵化仔鸡盲肠的优势菌属[16]；穆齐螺旋菌（Mucispirillum）定植于肠道黏膜层，可抵抗沙门氏菌增殖。SZ中显著富集的有弯曲杆菌属、未分类菌属的毛螺菌科（unclassified Lachnospiraceae）、罕见小球菌属（Subdoligranulum）和罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）等，大部分为有利于机体正常功能的生殖道定植细菌属。而RD、CD除假单胞菌属占总丰度的19.01%（相对丰度分别为21.81%、16.19%）、不动杆菌属占总丰度的10.01%（相对丰度分别为8.85%、11.05%）、未分类的肠杆菌科以及丛毛单胞菌属占明显优势外，其余属的相对丰度较小，有约47.35%～49.28%的属水平物种相对丰度小于1%，其中的明串珠菌属（Trichococcus），可利用多种碳水化合物发酵，产物主要为乳酸、乙酸和甲酸等，在低温下也能生长；片球菌属是人体有益菌，包含的两个种乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和戊糖片球菌于2010年卫生部明确可用于食品的菌种。这说明RD、CD的属水平物种组成更为复杂。

统计各组样本种水平上的物种丰度均值，通过热图可视化方法直观研究群落组成，图3c显示，种水平总丰度前50的物种和科水平物种层级聚类，左侧不同颜色图例代表不同的科水平物种。4 组样品中共检测到2408 个细菌种，分属于毛螺菌科62 个种，瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）41 个种，噬几丁质菌科（Chitinophagaceae）32 个种，厌氧绳菌科（Anaerolineaceae）28 个种，丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）25 个种，拟杆菌科（Bacteroidaceae）18 个种等。热图中60%的物种没有得到明确的种分类（unclassified）。如图3c所示，层级聚类分析可将物种分为A、B两大类，A大类的17 个种主要来源于变形菌门的不同科，RD、CD样品的丰度值明显大于SZ和MC，可见他们是影响这些物种聚类结果的主要因素。纵向观察热图，从条带颜色由绿色渐变为红色的变化可知，4 组样品丰度大小的顺序为CD＞RD＞ SZ＞MC。将A大类再聚类分为两个部分，第1部分中包含了14 个细菌种，丛毛单胞菌科有3 个种，其中睾酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）为条件致病菌且具有多重耐药性，同时对类固醇化合物具有降解作用；毛螺菌科的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）是对人体有益的乳酸菌，潜在生理活性包括抗炎抑菌、抗氧化和降血糖等；根瘤菌科（Rhizobiaceae）马尔他布鲁氏杆菌（Brucella melitensis）为人畜共患致病菌，不耐高温但传染性强，布鲁氏病已成为我国乙类传染病，导致长期发热乏力、关节痛等症状。第2部分虽然只有3 个种即假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌，并且在属或科水平上均为unclassified，但它们都是各组样品中丰度值最大的种，尤其在RD、CD中占绝对优势。假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌分别属于变形菌门的假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、莫拉菌科（Moraxellaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae），均为条件性致病菌，当人体机能免疫功能低下时能引起机体感染，同时具有产腐败酶能力[17]，对鸭蛋品质及货架期有潜在的危害，如假单胞菌产生的蛋白酶及嗜铁素导致蛋白质物质腐败并形成生物膜[18]。B大类包含的细菌种较多，大部分为unclassified或uncultured的物种，并且多为厌氧菌，丰度值表明主要是MC、SZ影响了这些物种的聚类结果。层级聚类将B大类再分为3 部分时，第1部分仅为加拿大弯曲杆菌（Campylobacter canadensis）1 个种，主要存在于SZ样品中，研究报道目前弯曲菌属中已鉴定19 个种，其中以空肠弯曲菌（C.jejuni）和结肠弯曲菌（C.coli）对人的感染最为普遍，是引起人类细菌性腹泻的主要原因，为此人们对畜禽肠道内弯曲菌特别是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌也进行了研究[19-20]，但加拿大弯曲杆菌鲜见报道。第2部分同样在SZ样品中占优势，共包括2 个种，其中的Caecibacterium sporoformans极为少见，是近期报道[21]从肉鸡盲肠内容物中分离出的新种，为一种严格厌氧的革兰氏染色阴性杆菌，有芽孢、不运动、过氧化氢酶阳性和氧化酶阴性，用梭状芽孢杆菌增殖培养液培养产生丁酸作为主要的代谢最终产物，其他生物学特性有待进一步研究；伯克霍尔德氏菌科（Burkholderiaceae）的皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii）被称为环境中无所不在的水生细菌，经驯化对重金属镉及苯酚有较强的降解能力[22]，但也是条件致病杆菌，能导致生物机体神经源性损害、呼吸困难等。第3部分中种类多且来源复杂，涉及拟杆菌门及厚壁菌门的30 个科，可以进一步层级聚类为多级和多个分支，优先聚类的可可拉拟杆菌DSM-17136（Bacteroides coprocolaDSM 17136）和未分类细菌种的副拟杆菌属（uncultured bacteriumParabacteroides）、未分类种的福涅拉氏菌属（unclassifiedFournierella）和未分类种的考拉杆菌属（unclassifiedPhascolarctobacterium）、未分类种的拟杆菌目（uncultured bacterium Bacteroidales）和致命梭杆菌ATCC-9817（Fusobaterium mortiferumATCC 9817），3 组仅6 个细菌种多达11 层级；另外，第3类中MC丰度值最大具有明显优势，如普雷沃氏菌属（Prevotella）、副拟杆菌属（Parabacteroides）等被称为肠道重要基石菌属。物种组成分析结果表明样品细菌种群复杂，但绝大部分为非致病性细菌。

2.4 样品细菌的基因功能预测

使用PICRUSt软件对4 组样品16S rDNA测序结果进行功能预测。根据抽平后的OTU丰度表，分别从PICRUSt储存库中配对其COG家族信息和PICRUSt Module信息并计算功能信息丰度。由图4a可知，所有样本的COG功能组成较为相似，主要有氨基酸转运与代谢（E）、翻译转录（K）、能量生产与转换（C）、碳水化合物转运与代谢（G）、无机离子转运与代谢（P）和脂质转运与代谢（I）等。其中RD和CD样品涉及脂质转运与代谢（I）、能量生产与转换（C）以及未知的功能（S）的丰度大，而在CM、SZ中涉及碳水化合物转运与代谢（G）和翻译转录（K）的COG功能信息丰度较高。

图4 COG功能和KEGG Module功能预测Fig.4 COG function and KEGG Module function prediction

根据KEGG Module数据库中有一系列用大写字母M和数字标识的功能单元用于基因组注释和生物学解释。图4b选取了KEGG Module功能信息丰度为前20的功能单元，以气泡大小表示丰度值大小。可知，4 组样品有很多功能单元的丰度基本相同，这些共有的功能维持细菌的正常生命活动。例如，糖酵解（M00001）使得大分子物质降解，获得分解产物和能量，组氨酸生物合成（M00026）能为细菌生长提供生长因子，糖异生协助氨基酸代谢等等，同时他们也会使内环境发生改变，导致蛋内容物腐败；相对而言，CD组和RD组比MC组、SZ组的气泡多气泡大，表明其功能丰度大，尤其是脂肪酸的生物合成（M00144）、血红素生物合成（M00121）、醌氧化还原酶（M00374）、二羧酸羟基丁酸酯循环（M00083）、庚二酰-ACP生物合成（M00572）几乎是CD组和RD组独有的功能单元，其中亚铁血红素生物（M00121）是病原菌生存所需的主要铁离子来源。

这些数据表明产蛋母鸭内组织样品和所产鸭蛋的功能预测结果相似，且代谢、遗传信息是检测样品中的主要功能，说明其蛋鸭的内环境功能稳态传递到鸭蛋，并影响鸭蛋品质或传递子代胚胎的内环境中。鉴于PICRUSt功能预测的局限性，4 组样品的内生菌属基因功能尚未完全清楚，有待进一步探究。

根据样品中细菌DNA的有效序列，使用BugBase工具进行表型预测，利用Kruskal-Wallis秩和检验比较各组样品8 大类表型的差异性，进行物种-表型贡献度分析，图5分别对8 大类表型贡献度高的物种逐一比较。革兰氏阳性主要贡献度物种为未分类菌属的毛螺菌科（48.11%）以及扭链瘤胃球菌属、未分类属的颤螺菌科（unclassified Oscillospiraceae）、塞利单胞菌属（Sellimonas）等；革兰氏阴性表型主要贡献度物种为假单胞菌属（34.46%）、拟杆菌属（21.17%）和丛毛单胞菌属等。MC和SZ组物种厌氧表型丰度高，分别为（43.6±0.95）%和（37.53±2.35）%，主要贡献度物种与革兰氏阴性物种相似，且还含有拟杆菌属和巨单胞菌属。RD与CD组物种在致病性和氧化胁迫耐受的表型相对丰度较高。图中显示对致病性表型贡献的物种主要为假单胞菌属、未分类属的肠杆菌科、丛毛单胞菌属和罗尔斯通氏菌属等，与表达氧化胁迫耐受表型的细菌物种组成相似，氧化胁迫会产生活性氧，氧化损伤生物分子，破坏细胞的新陈代谢。RD和CD组不同表型的细菌种类相同且丰度比例相似，另生物膜形成和移动元件表型丰度较高于MC和SZ组样品BugBase 表型。

图5 属水平物种-表型贡献度柱状图Fig.5 Bar graph of genus-level species-phenotype contribution degree

2.5 鸭蛋内容物与盲肠和生殖道细菌类群相关性分析

基于属水平物种绘制桑基图（图6a），结果显示MC和SZ对CD和RD种属的重叠率在13.84%～24.95%之间。RD、CD的占比组成相似，其中SZ与RD和CD分别为23.72%和24.95%，略高于MC，表明SZ菌群比MC菌群对蛋内容物（RD、CD）的细菌来源和组成影响更大。

图6 样品属水平物种相关性分析Fig.6 Correlation analysis of genus-level bacteria in samples

4 组样品拥有102 个共有菌属，相对丰度前50 位的共有菌属在各样品中的占比见图6b。MC与SZ、RD与CD共有菌属相对丰度大小的排序相似，MC与SZ中占比最大的是拟杆菌属，其相对丰度值分别为35.24%和20.08%，拟杆菌属人和动物肠道的正常菌群与人类具有共生关系，有助于分解食物并产生身体所需的营养和能量，然而，当拟杆菌属进入到除胃肠区域以外的身体部位，可造成危害。位居其次的为巨单胞菌属、未分类属的颤螺菌科、未分类属的毛螺菌科和分别排在第5的脱硫弧菌属（Desulfovibrio）与罕见小球菌属。RD与CD中相对丰度占比前3的共有菌属相同，为变形菌门的假单胞菌属、不动杆菌属和厚壁菌门中未分类属的肠杆菌科，这些物种产蛋白酶、脂肪酶的能力强，有的甚至能产生β-半乳糖苷酶及磷脂酶，对鸭蛋品质及货架期有潜在的危害。随后RD组与CD组分别有艰难杆菌属（Mogibacterium）、拟杆菌属和乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）相对丰度较高，艰难杆菌属被报道为与口腔疾病相关的口腔细菌[23]；肠球菌属是家禽中常见的病原体之一，可感染鸡胚和雏鸡，也与人类疾病密切相关。另外，相对丰度较小的副拟杆菌属占比2.19%，可消耗琥珀酸盐，从而以抑制部分梭菌属（Clostridium）的生长；而丹毒梭状芽孢杆菌属（Erysipelatoclostridium）、塞利单胞菌属与柯林斯氏菌属（Collinsella）等在动物肠道和生殖道偶有报道[24]。他们对产蛋鸭的健康和蛋品质都有一定的影响。

在属水平上利用LEfSe得到显著作用菌属（LDA值范围2～5），4 组样品的1319 个细菌属中有155 个显著作用菌属，其中RD 56 个、CD 58 个、MC 36 个、SZ 52 个。再使用FastTree软件通过选择属水平上分类信息对应序列的碱基，揭示出菌属进化顺序。根据最大似然法构建进化树与物种丰度组合图。如图7所示，左边为系统发生进化树，树枝长度为两个物种间的进化距离，右边柱状图展示的是物种在不同分组中的reads占比，不同颜色框内为对应样品的部分显著作用细菌。可以发现这些细菌分别分布在不同的分支，分属于厚壁菌门，变形菌门和拟杆菌门且具有同源性。MC和SZ组中显著作用细菌主要存在厚壁菌门和不动杆菌门，RD和CD显著作用菌属在变形菌门内聚集，位于进化分支末端，与组织样品保持一定的进化关系。样品细菌菌群中相对丰度占比最高的为拟杆菌属，位于进化树前端，说明拟杆菌属与样品中其他物种基因序列具有同源性。由此分析，蛋内容物的细菌物种与产蛋母鸭具有进化关系。

图7 物种系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree at the genus level

3 讨论

鸡鸭等家禽属于卵生动物，胚胎在卵中发育，因此雌性家禽的生殖道不是胚胎发育的场所，而是完整的卵（蛋）或受精卵的形成部位，包括蛋黄（卵巢）、蛋白（膨大部）、蛋壳膜（峡部）和蛋壳（子宫）等结构的形成[25]。病理情况下，侵染生殖道不同部位的致病性细菌菌群可以直接传递到蛋黄、蛋白、蛋壳膜和蛋壳中，如Gantois等[26]发现当沙门氏菌感染鸡的子宫、峡部和膨大部后，所形成鸡蛋的蛋壳、蛋膜和蛋白中也会存在沙门氏菌。然而，正常情况下是否有非致病性细菌菌群存在于蛋的形成过程中鲜见报道。在人类及哺乳动物生殖道细菌菌群研究中，人们从产后30～50 d健康奶牛子宫颈口采集的黏液中分离纯化得到乳酸菌[27]；并报道人、猪、犬、猴生殖道从菌群丰富度和多样性上均无显著差异，门水平上主要为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门[24]；另有研究表明，男女泌尿生殖道中均以乳杆菌属占优势，而且已经明确乳酸杆菌分解阴道上皮细胞中糖原产生乳酸，使阴道的pH值降低起到自净作用和维持阴道微生态平衡[28]。生殖道中存在与宿主相互依赖、彼此得益的定居菌群和由非致病性或潜在致病性的细菌菌群所组成的暂居菌群，对宿主的生长繁殖和机体健康产生重要影响。本研究从健康母鸭生殖道样品的菌落总数为4.70×107CFU/g，说明鸭蛋不是在无菌环境中形成，高通量测序分析结果表明其菌群结构与上述人及哺乳动物的研究报道相似，并非致病性细菌菌群，而且本研究蛋（硬壳蛋＋软壳蛋）内容物及生殖道细菌物种重叠率达24.35%，由此可理解为蛋内容物的一部分细菌来源于母体的生殖道。

盲肠菌群是动物消化道内各种细菌菌群的复杂生态系统，其结构和功能对宿主自身营养物质的消化、代谢、免疫功能以及生长繁殖都起着重要作用，盲肠菌群的相关研究已经成为热点，开展了人类、实验动物和猪、牛、禽类等多种食品动物肠道细菌种群多样性分析、功能预测以及影响因素的研究[29-30]。同时，人们进一步研究认为盲肠菌群定植可能始于宫内时期。子代肠道菌群定植过程可能是在生产前由胎盘或羊水中独特的细菌种群启动，出生后母体和后代之间通过母乳继续维持这种联系，从母体转移到婴儿的细菌种群构成了婴儿最初的胃肠微生物系统[31]。母鸡生殖道中一些细菌种群可通过蛋清（卵蛋白）转移到胚胎，构成胚胎肠道细菌的大部分种群[32]。通过研究母鸡、鸡胚和仔鸡肠道菌群以及母鸡生殖道不同部位的菌群，了解到母体肠道和生殖道细菌种群与胚胎发育、蛋产量关系密切[33]。另外在前期研究中发现在鸭蛋壳表面细菌中有肠杆菌属、肠球菌属以及梭菌属等与蛋内容物细菌相似[34]。本研究结果显示母鸭体内软壳蛋蛋内容物中存在大量的细菌基因序列，其中部分细菌种群与母鸭盲肠、生殖道菌群密切相关，物种重叠率分别达13.84%、23.72%。系统进化树分析发现鸭蛋内容物的显著作用细菌属群位于鸭体组织中细菌属群的进化分支中，具有一定的亲缘关系，且均与盲肠的显著作用菌属中拟杆菌属具有同源性。健康产蛋母鸭盲肠、生殖道的细菌是构成鸭蛋内容物非致病性细菌种群的重要来源之一。

本研究结果表明健康母鸭蛋内容物中含有一定数量的细菌基因序列，而菌落总数数量较少，这可能因为鲜鸭蛋的抑菌物质活性强。如果贮藏条件延长或改变，蛋内容物中细菌能迅速生长繁殖，导致品质下降[35]。另外，本研究得到的细菌中大部分为为非致病性种群，可能对母体甚至受精卵、胚胎不会造成危害，甚至有益无害，因为研究报道在饲料中添加有益菌，能调节母禽肠道菌群结构，进而提高禽蛋品质，例如张伟等[36]在基础饲粮中添加含有丁酸梭菌和屎肠球菌的复合微生态制剂，发现显著提高了鸡蛋的蛋黄重和哈夫值；张茜等[37]将丁酸梭菌联合竹醋液加入饲粮，以改善蛋壳厚度、蛋壳强度和和肠道功能。但是作为食品鸭蛋，由于在贮藏期间这些细菌的大量繁殖将导致蛋品腐败变质，缩短鲜蛋保质期；鸭蛋中所含细菌的种类和数量在加工过程中对其品质均有一定的影响。如蛋内所含的变形菌门弧菌属的麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）能在高碱环境下生长，具有产气能力，导致皮蛋“爆蛋”[38]。鸭蛋蛋黄所含金属离子的卵黄高磷蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，当增加肠道有益菌群时，机体合成更多的卵黄蛋白原进入卵子，卵黄高磷蛋白在咸鸭蛋加工过程中与Fe、S2-以及色素的共同作用增加蛋黄黑圈率[39]。因此，要加强对蛋鸭养殖的饲料管理和环境卫生控制，提高蛋鸭内环境稳态，延长其贮藏期，保障食品的安全。此外，应进一步研究有关鸭蛋内容物非致病性细菌的生物学特性，以优化鸭蛋制品加工工艺，从而生产出更加优质的产品。

4 结论

以健康产蛋母鸭及其同批所产鸭蛋为对象开展研究，结果显示，产蛋母鸭盲肠和生殖道组织与鸭蛋内容物的菌群结构复杂并具有重叠性，蛋内容物含有与母鸭盲肠、生殖道相同的细菌菌属，而体内软壳蛋与排出后硬壳蛋中细菌菌群结构相似。各组样品的细菌基因组DNA序列表达功能相似，均具有较强的代谢功能，且这些细菌具有一定的亲缘关系和同源性。在健康产蛋母鸭组织中大部分细菌为非致病性种群，可能对母体不会造成危害，但是进入鸭蛋后，细菌会迅速生长，造成蛋腐败变质，降低鸭蛋品质，缩短贮藏期。本研究表明，鸭蛋不是在无菌环境中形成，鲜鸭蛋中有细菌存在；健康产蛋母鸭生殖道和盲肠内的细菌菌群与鸭蛋内容物非致病性细菌来源有关，并对贮藏期鸭蛋腐败变质有 潜在影响。