87种植物提取物抑菌活性初步研究

王彩霞　兰妍彦　孟衍朴等

关键词 植物源农药；葡萄座腔菌；禾谷镰孢；抑菌活性；毒力测定

中图分类号：S 482.292 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022425

植物病害是导致农作物产量降低的重要原因之一，在植物病害中，由病原真菌引起的植物病害占70%～80%[1-2]。葡萄座腔菌Botryosphaeria do-thidea属于葡萄座腔菌属真菌，在世界各地广泛分布，可以引起许多果树病害，导致树势衰弱，果实产量和品质下降，严重时整树枯死，造成严重的危害和经济损失[1]；禾谷镰孢Fusarium graminearum在生产中主要引起小麦赤霉病、玉米茎基腐病和穗腐病及水稻穗腐病[4-5]，不但造成作物产量损失，而且可以产生毒素，使作物品质严重降低[6]。目前，对于这类病害的防治仍以化学防治为主，但化学农药的大量使用，不仅污染了环境也使该类病原菌产生了抗药性[7-8]，因此，研制针对该类病原菌的绿色农药迫在眉睫。植物源农药作为一种具有选择性高、对非靶标生物安全、低毒环保、易于降解、不易产生抗性等优点的绿色农药，已成为植物病害防治的研究热点之一[9-10]。

我国的药用植物资源十分丰富，其种类超过1万种，一些具有抑菌作用的药用植物成分已广泛应用于医药行业，其食用的安全性已得到充分证实，这为开发天然、安全、高效的植物源农药提供了理论基础[11-13]。毕秀莲等[14]通过对16种红树植物资源的筛选发现苦郎树Volkameria znermis和苦槛蓝Pentacoelium bontioides对甘蔗凤梨病菌Cerato-cystis paradoxa和柑橘疮痂病菌Elsinoe fewcetti具有较好的抑菌活性；周洁尘等[15]通过对13种植物资源的筛选发现垂序商陆Phytolacca americana和胜红蓟Ageratum conyzoides对胶孢炭疽菌Col-letotrichum gloeosporioides具有抑菌活性；张院民等[16]发现百部、虎杖和麦冬提取液对苹果青霉菌Penicillium sp.的抑制效果最好，具有开发成新型植物源杀菌剂的潜质。

本研究采用生长速率法评价了46科87种中药植物乙醇提取物对葡萄座腔菌和禾谷镰孢的抑菌活性；进一步测定高活性提取物的抑菌毒力和抑菌谱，以期筛选出较高抑菌活性的植物材料，为新型植物源杀菌剂的创制奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试菌株

葡萄座腔菌、禾谷镰孢、异旋孢腔菌Cochliobo-lus heterostrophus野生型和突变体以及拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides均由河北农业大学植物保护学院提供。将菌种接种到PDA培养基上，于（25±3）℃恒温箱中，培养5d左右，保留备用。

1.1.2供试植物

供试植物87种，分属于46科，購买于河北省安国市冷背药材有限公司，具体见表1。供试植物放于密封袋内保存备用。

1.1.3供试药剂

90%代森锰锌可湿性粉剂和98%多菌灵水分散粒剂购买自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2植物提取物的制备

采用超声波提取法[17]提取植物样品。加入无水乙醇，以料（g）：液（mL） =1：10进行提取，搅拌，每次30 min，共3次。用旋转蒸发仪将滤液蒸干，得到浓度为100 mg／mL的样品提取物，置于4℃冰箱，保存备用，用于抑菌活性的测定。

1.3带毒PDA培养基的制备

将马铃薯去皮切块，加入1L蒸馏水，煮沸10～20 min，至用勺子可碾碎即可。用纱布过滤，加蒸馏水至1L。加入琼脂和葡萄糖，加热融化，分装至锥形瓶中，于121℃高压湿热灭菌20 min。将一定量的植物乙醇提取物，用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，加0.1%的吐温-80水溶液，定容成3 mL的100 mg/mL的药液。分别移取0.3 mL植物提取物，加入15mL的已融化的PDA培养基中，摇匀。使带毒培养基浓度为2 mg/mL，混合均匀倒入已灭菌的培养皿内，冷却后即成带毒的培养基平板。

1.4供试菌的培养

于无菌操作台上，用打孔器打取直径为0.65 cm菌饼，接种至PDA培养基中央，于恒温培养箱中培养96 h待用。

1.5抑菌活性的测定

1.5.1植物提取物对葡萄座腔菌和禾谷镰孢的抑菌活性初步测定

采用生长速率法测定提取物的抑菌活性：待带毒培养基凝固后，用无菌打孔器在已活化的菌落边缘打取直径为0.65 cm的菌饼，用无菌镊子将菌饼接于上述带毒PDA平板正中心，每个培养皿接1个菌饼，于（25±3）℃恒温培养箱黑暗倒置培养。待对照组的菌落直径达培养皿直径的80%以上时，即可测量结果。采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3个重复，设置溶剂对照、空白对照和药剂对照。

1.5.2高活性植物提取物的抑菌毒力测定

对抑菌活性较好的植物提取物进一步进行毒力测定：采用二倍稀释法，将筛选出来的植物提取物稀释为5个待测浓度，每个浓度设置3个重复，设置溶剂对照、空白对照和药剂对照。

计算公式如下：

菌落直径=测量直径－菌饼直径；

抑制率=（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径×100%。

1.6高活性植物提取物的抑菌谱测定

采用生长速率法测定高活性植物提取物对异旋孢腔菌（野生型）、拟轮枝镰孢和异旋孢腔菌的抑菌活性。带毒PDA培养基制备同1.3。将直径6.5 mm的菌饼接入平板正中心，每个培养皿接入1个菌饼，每个处理3个重复，设置溶剂对照、空白对照和药剂对照。待对照组的菌落直径为培养皿直径的80%以上时，测量各组的菌落直径，计算抑制率。

1.7数据处理

相关试验数据用Excel、SPSS 22.0等软件分析。回归分析求出抑制中浓度（EC）、95%置信区间及毒力回归方程等参数。

2结果与分析

2.1 87种植物乙醇提取物对葡萄座腔菌和禾谷镰孢的抑菌活性

采用菌丝生长速率法测定了87种植物乙醇提取物对葡萄座腔菌和禾谷镰孢的抑菌活性，结果见表1。在2mg/mL的供试浓度下，各植物乙醇提取物对葡萄座腔菌表现出不同的抑菌活性，其中，厚朴、麻叶蟛蜞菊、木兰、细叶小檗、麦冬和丝瓜对葡萄座腔菌菌丝生长抑制效果较好，抑菌率达到50%以上，分别为95.80%、78.31%、54.65%、54.27%、52.59%、50.26%;白棠子树、乌药、秋子梨、郁李和葫蔓藤等抑菌率在40～6～50%之间，分别为47.84%、45.33%、44.02%、41.93%和40.70%。各植物乙醇提取物对禾谷镰孢表现出不同的抑菌活性，其中，厚朴、麦冬、乌药、丝瓜、桔梗（子实体）、桔梗（全株）和杜鹃兰对禾谷镰孢菌丝生长抑制效果较好，抑菌率分别为78.75%、66.52%，60.42%、59.81%、58.26%、57.39%、56.52%。郁李、紫萁、罗汉松、印度安息香、甘露子、榅椁、珊瑚菜、铁皮石斛对禾谷镰孢菌丝生长也具有一定的抑菌作用，抑制率在40%～50%。

2.2高活性植物乙醇提取物对葡萄座腔菌的抑菌毒力

进一步测定了厚朴和麻叶蟛蜞菊提取物对葡萄座腔菌菌丝生长的抑菌毒力（表2）。不同浓度麻叶蟛蜞菊提取物（0.25、0.5、1、2 mg／mL和4 mg／mL）对葡萄座腔菌均具有一定的抑菌效果（图1），随着处理浓度的增加，抑菌活性增强。处理96h后的ECo为1.57mg／mL。不同浓度厚朴提取物（0.04、0.08、0.16、0.32mg／mL和0.64 mg／ｍL）对葡萄座腔菌均具有一定的抑菌效果（图2），随着处理浓度的增加，抑菌活性增强，处理96 h后的ECo为0.10mg/mL。

2.3高活性植物乙醇提取物对禾谷镰孢的抑菌毒力

进一步测定了厚朴、乌药和麦冬提取物对禾谷镰孢菌丝生长的抑菌毒力（表3）。不同浓度厚朴提取物（0.125、0.25、0.5、1mg／mL和2 mg/mL）对禾谷镰孢均具有一定的抑菌效果（图3），随着处理浓度的增加，抑菌活性增强。处理96 h后的EC为0.45 mg／mL。不同浓度乌药提取物（0.5、1、2、4 mg/mL和8 mg/mL）对禾谷镰孢均具有一定的抑菌效果（图4），随着处理浓度的增加，抑菌活性增强。处理96 h后的EC为1.54 mg／mL。不同浓度麦冬提取物（0.5、1、2、4 mg／mL和8 mg/mL）对禾谷镰孢均具有一定的抑菌效果（图5），随着处理浓度的增加，抑菌活性增强，处理96 h后的ECso为4.07 mg/mL。

2.4高活性植物提取物抑菌谱测定

选取高活性植物乌药、麦冬、厚朴及麻叶蟛蜞菊提取物测定其抑菌谱，结果如表4所示。3种供试菌株在含药平板（2 mg/mL）上培养96 h的结果显示，4种植物提取物对3种供试菌株均有抑制作用，并且对于不同供试菌株的抑制率差异显著。其中，厚朴、麻叶蟛蜞菊、乌药及麦冬提取物对异旋孢腔菌野生型的抑菌率以及厚朴提取物对异旋孢腔菌的抑菌率均达到90%以上，厚朴、乌药及麻叶蟛蜞菊对拟轮枝镰孢的抑菌率在60%以上。

3结论与讨论

本试验选取了46科87种药用植物开展抑菌活性研究，发现厚朴和麻叶蟛蜞菊对葡萄座腔菌菌丝生长抑制率较高，其中厚朴对葡萄座腔菌菌丝生长抑制率超过90%；厚朴、麦冬和乌药对禾谷镰孢菌丝生长抑制率较高，其中厚朴对禾谷镰孢菌丝生长抑制率超过70%。抑菌谱测定结果表明，乌药、麦冬、厚朴及麻叶蟛蜞菊提取物对异旋孢腔菌野生型的抑菌率以及厚朴提取物对异旋孢腔菌的抑菌率均达到90%以上。通过该研究筛选出了多种具有农用抑菌活性的植物材料，因此，有必要加强对中药植物抑菌活性筛选，以期为植物源杀菌剂的创制提供资源。

本研究发现，厚朴、麦冬、乌药和麻叶蟛蜞菊等4种提取物对供试菌株表现出较强的抑制作用，具有进一步研究价值。厚朴是我国传统中药材，在医药和农用活性方面均有报道[18]。在医药上，厚朴提取物对4种口腔致病菌的生长均具有较强的抑制作用，并具有抑制致龋菌形成和促进其瓦解的作用[19]；刘桂兰等[20]的研究表明，厚朴总酚对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定的抗菌活性，最小抑菌浓度范围为8～16μg/mL。在农用活性研究方面，已发现厚朴提取物对马铃薯青枯病菌Ralstonia solanacearum的抑菌活性较好，最小抑菌浓度为0.1mg/mL[21]，并且已有研究表明厚朴酚及和厚朴酚为其主要抑菌成分[22]。麦冬为多年生常綠草本植物，其药理功效收载于《中国药典》中，主治健忘恍惚、肺燥干咳、津伤口渴等症，具有抗心肌缺血、抗血栓、抗炎和抗肿瘤等多种活性[23-24]；此外，麦冬提取液对水稻纹枯病菌Thanatephorus cucumeris具有一定的抑制作用。乌药为樟科植物乌药的干燥块根，具有镇痛抗炎、抗氧化、抑菌等生物学活性[25]。蟛蜞菊以全草或根人药，味甘淡，微寒，清热解毒，祛瘀消肿，主治白喉、百日咳、痢疾、跌打损伤等[26]。文献查询发现，除厚朴提取物外，麦冬、乌药和麻叶蟛蜞菊等3种提取物的抑菌活性均未见系统研究，具有进一步开发的前景。

由此可见，厚朴、麦冬、乌药和麻叶蟛蜞菊等4种植物的提取物具有较强的抑菌作用，对其进行系统深入地研究有望开发出新型植物源杀菌剂。