智能聪配施壳寡糖和褐藻寡糖对烟草生长和病毒抗性的影响

张晓英　王胜　王洪凤等

关键词 马铃薯Ｘ病毒； 智能聪； 促生； 抗病； 壳寡糖； 褐藻寡糖

中图分类号： Ｓ４３２．４ 文献标识码： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２２２８

植物病毒病严重阻碍农业绿色生产和可持续发展。马铃薯Ｘ病毒（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，ＰＶＸ）是世界范围内在烟草和马铃薯等作物上普遍发生且危害严重的侵染性病毒［１２］。由ＰＶＸ引起的烟草花叶病造成烟草减产１０％～８０％［３］，对以烟叶为支柱产业的地区和烟农造成巨大经济损失［４］。由于病毒的绝对寄生性，目前针对植物病毒没有特效药剂。

壳寡糖是植物识别病原物的非特异性信号，通过诱导植物本身的防卫反应提高其对病害的抵抗能力［５］，壳寡糖在田间对烟草花叶病毒病的防治效果可达２０％～４０％［６］。褐藻寡糖不仅具有抗菌和抗氧化作用，还能调节植物免疫应答［７８］，盆栽试验发现０．２０％的褐藻寡糖可以有效诱导植物抵抗烟草花叶病毒病（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）的侵染，对病毒抑制率可达９０．４％［９］。宛氏拟青霉Paecilo-myces variotii经过发酵获得的提取物智能聪（ＺＮＣ）是一种超高活性的植物免疫诱抗剂，可以作为诱导因子诱导植物免疫应答，引起植物体内活性氧（ＲＯＳ）暴发、胼胝质沉积和病程相关蛋白基因（ｐｒｏ-ｔｅｃｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ，ＰＲ）的表达；智能聪通过苯丙氨酸解氨酶（Ｌ-ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｍｍｏｎｉａ-ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ）途径促进水杨酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ，ＳＡ）的积累，调控ＲＮＡ 沉默相关标志基因NBDCL３的表达来提高烟草抗ＰＶＸ的能力［１０］，盆栽和田间试验均表现出对病毒病有较为显著的防治效果［１１１２］。

目前，农药仍是马铃薯Ｘ 病毒病的重要防治手段，但也随之造成严重的人畜健康、环境安全及病毒抗药性问题，阻碍了烟草行业的健康发展。为筛选能够有效防治马铃薯Ｘ 病毒病的药劑，本试验以模式植物本氏烟为研究对象，研究智能聪分别配施壳寡糖和褐藻寡糖对烟草生长的促进作用及抵抗ＰＶＸ侵染的效果，为防治由ＰＶＸ引起的烟草花叶病毒病的复配药剂筛选提供科学依据。

１材料与方法

１．１试验材料

宛氏拟青霉Puecilom yces variotii提取物智能聪，有效成分７．５ｍｇ／ｍＬ，由山东蓬勃生物科技有限公司提供；９０％壳寡糖原药和９０％褐藻寡糖原药由南阳朴欣肥业有限公司提供。

供试植物为本氏烟Nicotiana benthamiana。挑选大小、长势一致、无病无虫的４～８叶龄幼苗用于试验。

带有绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）基因的马铃薯Ｘ病毒（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，ＰＶＸ）由山东农业大学朱常香老师课题组提供。

其他试剂和仪器主要有：石英粉（过６００目筛）、碳酸盐缓冲溶液（ＣＢＳ，ｐＨ９．６）、马铃薯Ｘ 病毒酶联免疫分析试剂盒（上海源桔生物科技有限公司）、酶标分析仪（美国伯腾仪器有限公司）、３６５ｎｍ 长波紫外灯（美国ＳＰＥＣＴＲＯＬＩＮＥ）、研磨器等。

１．２试验方法

试验在温度２３℃，相对湿度５０％～６０％，光照６０００～７０００ｌｘ的人工气候室中进行。药剂用水稀释后均匀喷施于长势均匀的烟草植株叶片正面，以喷施清水为对照（ＣＫ）。每７ｄ喷施１次，共喷雾２次。试验设６个处理（表１），每处理喷施６株，即６个重复。

病毒接种试验在第２次喷施药剂后２ｈ进行，首先在烟草未完全展开幼叶下方的３片展开叶正面均匀撒少许石英粉，采用摩擦接种的方式每叶接种５０μＬ含ＰＶＸ 的病毒汁液，每处理接种６株，即６个重复，接种后将植株放于人工气候室内继续培养，５ｄ后在长波紫外光下观察接种烟草发病情况，取每株发病的幼叶，用锡箔纸包裹并写好编号，于液氮速冻后保存于－８０℃冰箱中待用。

１．３生长指标及开花数量测定

分别测量第１次喷药前、第１次喷药后７ｄ、第２次喷药后７ｄ各处理的株高，并于第２次施药后７ｄ测量各处理烟草的根长、侧根数、全株鲜重和干重，统计开花数量。

１．４ELISA检测病毒含量，计算病毒抑制率

取接种病毒后５ｄ已发病的不同处理叶片样品按照０．１ｇ（叶片重量）∶１ｍＬ（碳酸盐缓冲溶液）的比例进行研磨，研磨液倒入离心管里，５０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，取上清液于干净的离心管内，按照马铃薯Ｘ病毒酶联免疫分析试剂盒的操作步骤测定样品中马铃薯Ｘ病毒含量，以４５０ｎｍ波长处的ＯＤ值表示。

参照马志强等的方法［１３］，以对照和处理之间的马铃薯Ｘ病毒含量（ＯＤ）的差异计算各处理对病毒的抑制率。

病毒抑制率＝（对照组ＯＤ－处理组ＯＤ）／对照组ＯＤ×１００％。

１．５数据分析

试验所得数据采用ＳＰＳＳ１４．０软件中ＤＭＲＴ法进行显著性检验并计算各处理的标准误差，采用ＩｍａｇｅＪ软件进行发病叶片荧光强度的量化。

２结果与分析

２．１智能聪配施壳寡糖和褐藻寡糖对烟草生长的影响

智能聪配施壳寡糖和褐藻寡糖对烟草株高的促进作用显著优于单剂。喷施两次不同单剂后，幼苗株高均显著高于对照。其中，第１次喷施后７ｄ，智能聪处理组的株高比对照增加１７．９１％，壳寡糖处理组增加１３．４６％，褐藻寡糖处理组增加８．６３％。第２次喷施后７ｄ，株高增加率分别为１９．５０％、１１．２５％和１１．４８％，其中智能聪处理株高显著高于其他２个单剂处理，促生效果最好。智能聪分别配施壳寡糖和褐藻寡糖对烟草幼苗株高的促进作用均显著高于单剂，其中智能聪与壳寡糖复配处理的烟草株高比单施壳寡糖增加１３．８９％～２５．２４％，与褐藻寡糖复配处理的烟草株高比单施褐藻寡糖增加２６．３１％～４８．７０％（图１）。

智能聪与壳寡糖和褐藻寡糖复配均表现出较好的促根系生长作用。智能聪与壳寡糖复配处理的主根长、鲜重显著高于壳寡糖单用（犘＜０．０５），分别增加１６．００％、１５．５７％，侧根数、干重虽高于壳寡糖单剂处理，但差异不显著，分别增加１１．９５％、１６．６０％。智能聪与褐藻寡糖复配处理的主根长、侧根数、鲜重和干重显著高于褐藻寡糖单剂处理，分别增加２０．４１％、２３．２０％、２３．６０％和３１．０３％（图２）。这表明，智能聪配施褐藻寡糖对烟草生长具有较好的促进作用。

２．２智能聪配施壳寡糖和褐藻寡糖对烟草植株开花的影响

施用智能聪、壳寡糖和褐藻寡糖可增加烟草植株的开花数量，其中智能聪和壳寡糖配施时促进作用最好。壳寡糖和褐藻寡糖分别配施智能聪相对单剂表现出较好的增效作用，其中，壳寡糖与智能聪复配时开花数量比单剂处理增加５６．２５％；褐藻寡糖与智能聪复配时开花数量比单剂处理增加８３．３４％（图３）。

２．３智能聪配施壳寡糖及褐藻寡糖对烟草对PVX病毒抗性的影响

叶面喷施各处理药剂后２ｈ接种ＰＶＸ病毒，培养５ｄ后在长波紫外灯下观察各处理叶片的荧光强度，并检测发病烟草植株叶片的病毒含量。结果显示，各处理组叶片的荧光强度经过量化后存在显著差异，其中荧光强度最低的是智能聪配施壳寡糖，抑制效果最为明显（图４，图５）。各处理组烟草叶片中病毒的含量均显著低于对照，其中病毒含量最低的为智能聪复配壳寡糖，其次為智能聪复配褐藻寡糖处理（图６）。３种药剂单用对ＰＶＸ均有较好的抑制作用，智能聪处理显著优于壳寡糖和褐藻寡糖处理，病毒抑制率分别为６６．８６％、４８．１１％和４５．５０％（表２）。智能聪与壳寡糖或褐藻寡糖配施均能较好地抑制ＰＶＸ，其中与壳寡糖配施处理对病毒抑制率为７１．２６％，与褐藻寡糖配施时病毒抑制率为６８．４８％。因此，智能聪对两种药剂均有较明显的增效作用，与壳寡糖复配对病毒的抑制作用比壳寡糖单用增加４８．１２％，与褐藻寡糖复配比褐藻寡糖单用增加５０．６５％（图６，表２）。

３结论与讨论

３．１智能聪、壳寡糖和褐藻寡糖对烟草的促生作用

本研究发现，施用智能聪、壳寡糖和褐藻寡糖对烟草幼苗的生长均表现出较好的促进作用，与之前的报道基本一致［１２，１４１５］。为了进一步提高药剂效果，本研究将智能聪分别配施壳寡糖和褐藻寡糖，评价其对烟草促生和抗病毒病的效果。研究结果证明复配制剂对烟草的促生作用显著高于单用壳寡糖和褐藻寡糖。智能聪可促进拟南芥的生长、发育［１６］，本研究发现其也能促进烟草的生长，但关于智能聪如何调控烟草生长的机制还需进一步研究。

３．２智能聪、壳寡糖和褐藻寡糖对烟草的抗病作用

免疫诱抗剂智能聪对田间的烟草病毒病具有较好的防治效果，叶面喷施１ 次５００ｎｇ／ｍＬ 的智能聪，对烟草病毒病的防治效果可达５７．０７％［１２］，本研究显示，叶面喷施２次５０ｎｇ／ｍＬ的智能聪对ＰＶＸ的抑制率可达６６．８６％，可能是试验所用的烟草品种不同，并且室内培养条件下病毒来源等稳定可控，而田间环境因素复杂多变，烟草病毒病多是多种病毒复合侵染，因此存在一定的差异。

褐藻寡糖主要是通过水杨酸（ＳＡ）信号途径及胼胝质沉积等抵抗ＰＶＸ、ＴＭＶ 的侵入［１７］，进而增强烟草对两种病毒的抗性。壳寡糖主要通过诱导烟草表皮产生ＨＯ 和ＮＯ信号分子来提高烟草抗病毒侵染的能力［１８］，因此其对ＴＭＶ 具有较好的防治效果，本试验中对ＰＶＸ的防治效果均与上述结果相符。褐藻寡糖在室内烟草抗ＴＭＶ 试验中对ＴＭＶ的抑制率可达９０．４％［９］，而本试验中褐藻寡糖对ＰＶＸ的抑制率较低，可能是试验所用病毒不同以及褐藻寡糖用量较少。

智能聪分别与壳寡糖和褐藻寡糖复配对病毒的抑制均表现出较好的作用。其中效果最好的是智能聪与壳寡糖复配，对病毒的抑制率为７１．２６％；其次是智能聪与褐藻寡糖复配，病毒抑制率为６８．４８％。两种复配对ＰＶＸ的抑制率存在一定差异，具体原因还有待进一步研究。

本试验结果表明，智能聪、壳寡糖和褐藻寡糖对烟草均有较好的促生作用并能提高烟草抗ＰＶＸ的能力。智能聪与壳寡糖和褐藻寡糖复配，对烟草的促生作用和抗病毒效果显著优于单剂，其中促生效果最好的复配制剂为０．０５μｇ／ｍＬ的智能聪加１２μｇ／ｍＬ的褐藻寡糖，抗马铃薯Ｘ病毒效果较好的复配制剂为０．０５μｇ／ｍＬ的智能聪加３０μｇ／ｍＬ的壳寡糖。