4种植物挥发油的化学成分分析及其对赤拟谷盗的生物活性

刘晶　蒋超　刘鼎阔等

关键词 飞机草；假蒟；紫穗槐；毛麝香；GC-MS；触杀活性；驱避活性

中图分类号：S 379.5 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022422

赤拟谷盗Tribolium castaneum属鞘翅目拟步甲科，是世界性仓储害虫[1]。赤拟谷盗食性广，主要蛀食小麦、玉米及中药材等[2]。该昆虫繁殖速度快，并且其分泌物中含有苯醌等致癌物质，被害物受污染后易结块、发臭，不仅造成资源浪费，还会对人类健康产生潜在威胁[3]。目前，常用的仓储害虫防治方法有高温防治法、低温冷藏法和化学药剂防治法等，其中，化学药剂防治方法应用最为广泛，但长期、过量使用会导致害虫耐药性增强，环境污染，并对人类健康造成潜在威胁[2]。与传统的化学药剂相比，植物源杀虫剂因具有作用机制多样、低毒和环境友好等特点受到了广泛关注[4]。挥发油是一种植物次生代谢物质，具有特殊的芳香气味，其主要成分为萜类和苯丙素类物质，在植物源农药领域的应用已具一定规模，其中，用于仓储害虫防治的八角茴香油年产量已突破千吨大关[5-7]。

本文在对挥发油生物活性的研究中发现，飞机草Chromolaena odorata、假蒟Piper sarmentosum、紫穗槐Amorpha fruticosa和毛麝香Adenosma glutinosa挥发油具有触杀和驱避活性。飞机草为菊科飞机草属草本植物，主要分布于海南和云南等地区，其化学成分以黄酮类、萜类和挥发油类为主[8-9]。飞机草乙醇提取物对褐飞虱Nilaparvoata lugens有驱避作用，而其挥发油对荔枝蒂蛀虫Co-nopomorpha sinensis和柳毒蛾Leucoma salicis分别具有驱避和毒杀作用[10-12]。假蒟为胡椒科胡椒属多年生草本植物，大多生长在热带湿润地区，主要含有萜烯类、酸类、醚类和醇类等化学成分[13-15]。假蒟挥发油对小菜蛾Plutella xylostella具有良好的驱避活性[16]，而其石油醚提取物对皮氏叶螨Tetrany-chus piercei、螺旋粉虱Aleurodicus dispersus具有较好的杀虫活性[15，17]，其乙醇提取物对椰心叶甲Brontispa longissima具有较好的拒食活性[18]。紫穗槐为豆科紫穗槐属多年生落叶灌木，在我国东北、华北和西北等地区广泛种植，其含有黄酮类、二苯乙烯苷类和挥发油类等化学成分[19-21]。紫穗槐种子的乙醇提取物对淡色库蚊Culex pipiens pallens和小菜蛾具有杀虫活性[19，22]，而其鲜叶的乙醇提取物对大皱鳃金龟甲Trematodes grandis有良好的毒杀作用[23]。毛麝香为车前科毛麝香属草本植物，大多分布于我国广东、广西及云南等地[24-25]。其含有丰富挥发油、萜类和黄酮类等化学成分，在西双版纳常被用作驱虫剂[26-27]。

本文对这4种植物的挥发油进行化学成分分析，并评价其对仓储害虫赤拟谷盗的触杀和驱避活性，以期为上述植物的开发及利用提供理论基础。

1材料与方法

1.1供试昆虫

赤拟谷盗于2017年6月引种自北京师范大学资源学院。将干净的小麦磨成粉状，与酵母粉按10：1的比例混匀，装入玻璃瓶内，每瓶接种40～50头成虫，盖上纱布，用皮筋固定，置于培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）中，在28～30℃、相对湿度70%～80%，黑暗条件下饲养。试验所用的昆虫为羽化后1～2周的成虫。

1.2植物材料

植物样品的采集信息見表1。采集样品均经天津农学院动物科学与动物医学学院尤春雪老师鉴定。其中，飞机草、假茹和毛麝香样品为地上部分，紫穗槐样品为枝叶及果实。植物样本保存于天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室。

1.3挥发油的提取

将4种植物切碎后，分别放入挥发油提取器中，采用水蒸气蒸馏法，提取5～7 h，收集挥发油，用无水硫酸钠（NaSO）去除水分，将得到的挥发油置于4℃冰箱中密封保存。

1.4挥发油的GC-MS分析

采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，QP2010SE型，日本岛津）对挥发油的化学成分进行鉴定。色谱柱选用Rtx-5Sil MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），起始柱温设定为85℃，保持4 min，然后以10℃/min升至200℃，在此温度下保持2 min后以15℃/min升温至280℃，保持10 min。扫描范围为80～600 m/z，离子化方式为EI，载气为氦气，流速为1.0 mL/min。通过与标准谱库（NIST 14.0）中的化合物对比，鉴定5种挥发油的化学成分组成，采用面积归一法计算其相对含量。

1.5触杀活性

根据Feng等[28]的方法测定植物挥发油对赤拟谷盗的触杀活性。每种植物挥发油分别采用50%、10%和2%3种浓度进行预试验，以寻找合适的检测浓度。用移液枪吸取0.5μL样品稀释液滴于赤拟谷盗的前胸背板，处理后，将试虫放入玻璃瓶中，饲养条件同1.1。以正己烷为空白对照，每个浓度重复5次，每个重复处理10头试虫，整个试验重复3次，24 h后观察并记录试虫的死亡率。

1.6驱避活性

根据You等[29]的方法测定植物挥发油对赤拟谷盗的驱避活性。配制5个浓度（78.63、15.73、3.15、0.63、0.13 nL/cm）的供试溶液，将滤纸（直径9cm）剪成2等份，用移液枪吸取500μL供试溶液均匀滴在其中一份上作为处理，另一份用等量的正己烷处理作为对照。待溶剂自然挥发后，将两份滤纸紧贴在培养皿（直径9cm）底部。每个培养皿在中心接入20头试虫。每处理重复5次，整个试验重复3次。同时以市售驱避剂避蚊胺（DEET，纯度>98%，购自TCI开发有限公司，上海）作为阳性对照。分别于2、4h统计不同区域的试虫数量，计算驱避率（PR）：

PR=[（N-N）/（N+N）]×100%。

其中，N是对照区试虫数量，N是处理区试虫数量。求出平均PR值和标准误。在驱避试验中，每种挥发油有5个测试浓度和两个时间点，共10个PR值，很难直观比较驱避活性。因此引入灰色关联度分析，基于相对关联度r对驱避活性进行比较，r值越大，驱避活性越显著。相对关联度r的计算方法参照You等[30]。

1.7统计分析

采用SPSS 21.0进行数据分析。采用Probit分析计算半数致死量（LD）。采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较法比较不同样本驱避率的差异显著性，显著水平设置为a=0.05。在方差分析和Tukey多重比较前数据先进行反正弦平方根变换。

2结果与分析

2.1挥发油提取结果

飞机草、假蒟、紫穗槐和毛麝香挥发油提取结果见表2。在提取飞机草挥发油过程中，2h之前挥发油在水上方，采用轻油提取器进行提取，2h之后挥发油在水下方，改用重油提取器，因此，将这两种挥发油分别记为飞机草轻油和飞机草重油。

2.2挥发油的化学成分分析

飞机草、假蒟、紫穗槐和毛麝香挥发油的化学成分分析见表3，共鉴定出100种成分，其中，飞机草轻油和假蒟挥发油以倍半萜类成分为主，飞机草重油、紫穗槐和毛麝香挥发油以单萜类成分为主。飞机草轻油主要成分有肉豆蔻醚（34.32%）、β-石竹烯（22.35%）和（－）-α-古芸烯（12.14%）。飞机草重油主要成分有肉豆蔻醚（46.58%）、β-石竹烯（17.98%）和α-古巴烯（7.34%）。假蒟挥发油中β-胡椒烯（18.23%）、β-石竹烯（14.60%）和萘，1，2，3，5，6，8a-六氢化-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）（10.05%）含量较高。紫穗槐挥发油主要成分有α-蒎烯（26.31%）和早熟素Ⅰ（7.46%）。毛麝香挥发油成分含量较高的有γ-松油烯（24.90%）、环葑莰烯（16.59%）、双戊烯（11.57%）和桉叶油醇（11.42%）。其中，5种挥发油均含有β-石竹烯，其含量在3.10%～22. 35%之间，飞机草轻油、飞机草重油、假茹挥发油和毛麝香挥发油共有成分为萘，1，2，3，5，6，8a-六氢化-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基），其含量在0.87%～10.05%之间。

2.3挥发油触杀活性

5种植物挥发油对赤拟谷盗均有触杀活性，结果如表4所示。其中，紫穗槐挥发油的触杀活性最强，其24h的LD为44.08μg/头，其次是毛麝香挥发油（LD=51. 69μg/头）、假蒟挥发油（LD=51.94μg/头）和飞机草轻油（LD=58.83μg/头），飞机草重油的触杀活性最弱，LD为62.73μg/头，紫穗槐挥发油的触杀活性是其1.42倍。

2.4挥发油驱避活性

5种植物挥发油对赤拟谷盗的驱避活性结果见图1。在高浓度78.63nL/cm下，2h和4h均是毛麝香挥发油的驱避率最高，PR值分别为94%和100%；在浓度为15.73 nL/cm时，假蒟挥发油在2h和4h的驱避率均是最高，PR值分别为100%和96%；在3.15nL/cm浓度下，飞机草重油在2h驱避率最高，PR值为86%，假蒟挥发油在4h驱避率最高，PR值为84%;在浓度为0.63nL／cm时，2h和4h毛麝香挥发油驱避率均是最高，PR值均为76%；在最低浓度0.13nL/cm，毛麝香挥发油在2h和4h的驱避率皆为最高，PR值分别为72%和76%。

由此可知，不同浓度和时间，挥发油样品的驱避活性存在差异，仅通过驱避率很难直观地比较多个样品的驱避活性，因此，本文引入“灰色关联度法”评价驱避活性，结果见表5。飞机草重油、假蒟挥发油、紫穗槐挥发油和毛麝香挥发油呈现显著的驱避活性，其r值均大于阳性对照避蚊胺，其中，毛麝香挥发油的驱避活性最为显著，其r值为0.6572，因此毛麝香具有开发成天然驱避剂的潜力，可用于仓储害虫的防治。

3结论与讨论

Sharma等[32]的研究表明，印度迪布鲁加的飞机草鲜叶挥发油密度为0.796g/mL，主要成分有吉枝烯（25.10%）、锗烯D（20.27%）、β-石竹烯（10.04%）、α-蒎烯（9.64%）和β-蒎烯（4.85%），其中吉枝烯含量最高。与本研究的飞机草挥发油相比，共有成分为j石竹烯，但本研究中含量最高的成分为肉豆蔻醚。Hieu等[33]从越南假蒟茎、叶中提取的挥发油主要成分为苯甲酸苄酯（49.1%）、苯甲醇（17.9%）、2-羟基苯甲酸苯甲酯（10.0%）和2-丁烯基苯（7.9%），与本文中的假茹挥发油相比，两者的主要成分中并没有相同的成分。Lis等[34]于波兰中部采集的紫穗槐鲜叶中提取的挥发油的主要成分有旷桉叶醇（13.9%）、（E）-P-柠檬烯（11.9%）和α-蒎烯（11.8%）。与本试验的紫穗槐挥发油进行对比发现，两者主要成分中均有α-蒎烯，但含量差异较大。杨东娟等[27]从广东省潮州市的毛麝香中提取的挥发油的主要成分是柠檬烯（24.40%）、桉树醇（19.82%）、葑酮（19.36%）、红没药烯（8.24%）、α-蒎烯（6.98%）和γ-松油烯（6.78%），與本文毛麝香挥发油主要成分相比，两者均有γ-松油烯，但含量差异较大。经以上分析得知，本试验中挥发油的成分和含量与文献报道存在差异，可能是由于采集时间、地理位置、气候和储存时间不同，而这些差异可能会导致挥发油生物活性不同[35]。

触杀活性测定结果表明，这5种植物的挥发油对赤拟谷盗均具有一定的触杀活性，活性由强到弱依次为紫穗槐挥发油>毛麝香挥发油>假蒟挥发油>飞机草轻油>飞机草重油，其中，紫穗槐挥发油的触杀活性最强，其24 h的LD为44.08μg/头。虽然其对赤拟谷盗触杀活性弱于阳性对照除虫菊酯，但要强于一些文献报道的挥发油，例如：Liang等[36]研究发现，灌木亚菊挥发油对赤拟谷盗的LDso为105.67μg/头；吴彦等[37]研究表明，侧柏叶挥发油对赤拟谷盗触杀活性的LD为48.59μg/头。因此，紫穗槐挥发油具有开发为植物源杀虫剂的潜力。Luo等[38]研究发现，肉豆蔻醚对赤拟谷盗的触杀活性LDso为39.48μg/头，Cao等[39]研究表明，旷蒎烯对赤拟谷盗的触杀活性LD为30.09μg/头，Luo等[40]研究发现，γ-松油烯对赤拟谷盗的触杀活性LD为35.60μg/头，因此，紫穗槐挥发油主要成分旷蒎烯的触杀活性最强，其次是毛麝香挥发油主要成分γ-松油烯，最后是飞机草轻油和重油主要成分肉豆蔻醚，由此推测，挥发油的触杀活性与其主要成分的活性有一定的相关性。

此外，5种挥发油对赤拟谷盗均具有一定的驱避活性，且飞机草重油、假茹、紫穗槐和毛麝香挥发油的驱避活性强于阳性对照避蚊胺，其中毛麝香挥发油的驱避活性最为显著。并且，飞机草重油、紫穗槐和毛麝香挥发油的驱避活性呈现浓度依赖性，随着浓度的降低，驱避率减小；飞机草轻油、飞机草重油、假蒟和紫穗槐挥发油的驱避活性呈现时间依赖性，随着时间的延长，驱避率降低。文献已有类似报道，Guo等[41]研究7种药物对仓储害虫的生物活性发现，苍术、艾蒿和野薄荷挥发油的驱避活性呈现浓度依赖性，高良姜和草果挥发油呈现时间依赖性。根据驱避效率和驱避时间的不同，挥发油及其主要成分的驱避效果可分为3种模式，第一种是高效型，即在高浓度作用良好，随着浓度降低作用效果下降；第二种是持久型，即在所有测试浓度下都表现出稳定的效果；第三种是两者兼备[42]。因此，本文中假蒟挥发油属于高效型，在高浓度时驱避活性良好，随着浓度降低作用效果逐渐下降。飞机草轻油、飞机草重油、紫穗槐和毛麝香挥发油属于两者兼备，在高浓度时驱避活性良好，在低浓度时仍表现出良好的驱避作用。而阳性对照避蚊胺属于高效型，随着浓度降低作用效果下降。因此，飞机草轻油、飞机草重油、紫穗槐和毛麝香挥发油的驱避活性比阳性对照更为显著可能是由于其兼具高效型和持久型的特点。

综上所述，本文研究了飞机草、假蒟、紫穗槐和毛麝香挥发油的化学成分组成及其对仓储害虫赤拟谷盗的触杀和驱避活性。结果表明，紫穗槐挥发油的触杀活性最為显著，毛麝香的驱避作用效果最好。以上结果为这4种植物作为植物源农药提供理论基础，但其抗虫机制还需进一步研究。