木霉生物合成纳米铜条件优化及其对甜瓜枯萎病防效的研究

崔晓慧　钟震　姚薇等

关键词 木霉； 纳米铜； 合成优化； 尖镰孢； 抑菌作用

中图分类号： Ｓ４３６．５ 文献标识码： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２１８８

纳米技术作为一门多学科交叉的创新技术和最具发展前景的新兴技术，已经在电子、医药、国防和农业等领域被广泛应用。金属纳米粒子因其高表面积／体积、高导热（电）性和高催化性能等优异的物理和化学性质而备受关注［１］。过去几十年，关于金属纳米粒子制备方法（物理法、化学法和生物法）一直是研究热点，其中生物法因其方法简便、生产成本低和环境友好而被广泛关注［２３］。目前植物［４］和微生物［５］及其提取物可作为封端剂和还原剂用于纳米材料的生物合成。与植物和细菌相比，丝状真菌能够产生可还原金属离子和稳定金属纳米粒子的有机物质，使纳米粒子具有更好的生物相容性［６］。木霉Trichoderma是重要的植物病害生防菌，同时也用来生产工业酶和抗生素［７］，在工农业中发挥着重要的作用。木霉容易在实验室和工厂内大规模培养，对培养条件要求不高、生产成本低，因此被广泛用来生产金属纳米粒子［８１２］。纳米粒子合成的速率取决于金属离子的浓度、还原剂的类型、ｐＨ、温度和反应时间［１３１５］。纳米铜粒子（Ｃｕ-ＮＰｓ）合成过程中，Ｃｕ（Ⅱ）被微生物代谢产生的各种还原性物质还原为Ｃｕ（０）。纳米铜粒子与空气接触容易在其表层形成ＣｕＯ-ＮＰｓ或ＣｕＯ-ＮＰｓ［１６１７］，而微生物代谢产生的大分子物质可以作为封端剂或稳定剂，防止粒子聚集，增加粒子的稳定性［１８］，在一定程度上能够避免Ｃｕ-ＮＰｓ氧化为ＣｕＯ-ＮＰｓ或ＣｕＯ-ＮＰｓ［１６］。生物合成的纳米铜相比于其他金属纳米粒子（纳米银或纳米金）生产成本低且具有独特性能。此外，虽然铜氧化物纳米粒子在热力学上比纳米铜粒子更稳定，但其可能会影响纳米粒子的其他性能，故其应用受到一定限制［１９］。纳米铜对茎点霉Phoma destructiva、链格孢Alternaria alternata、弯孢菌Curvularia lunata和尖镰孢Fusarium oxysporum都具有良好的抗菌活性，能够抑制其菌丝的生长［２０］。另外，高表面积的纳米材料能够有效地保留养分，可以不断为植物提供养分，同时也可以改善化学农药的溶解性和分散性，提高农药的有效性［２１２２］。因此纳米铜具有较高的抗菌活性［２３］，可以抑制真菌［２０］和细菌的［２４］生长，浓度越高，杀菌效果越好。

近年来，随着我国设施栽培的发展，甜瓜种植面积不断扩大，由尖镰孢引起的甜瓜枯萎病发生日趋加重，发病率高达５０％～７０％［２５］，造成甜瓜产量和品质下降［２６］。目前农业上仍采用化学农药防治枯萎病，但化学农药容易造成瓜果品质下降、污染环境和病原菌产生抗药性［２７］。因此，环境友好型且不易使病原菌产生抗药性的生物杀菌剂是未来生防制剂的发展方向。本研究以木霉发酵液为还原剂和稳定剂合成Ｃｕ-ＮＰｓ，通过ＵＶ-ｖｉｓ光谱表征探究不同合成条件对木霉合成Ｃｕ-ＮＰｓ的影响，以期明确木霉合成Ｃｕ-ＮＰｓ的最适条件。同时研究Ｃｕ-ＮＰｓ对尖镰孢的抑菌活性和对甜瓜枯萎病的防效，为开发农用新型药剂及木霉和纳米铜综合防控甜瓜枯萎病奠定理论基础。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１试验菌种

长枝木霉Trichoderma longibrachiatum分离于柞树根系，保存于沈阳农业大学生物科学技术学院实验室。尖镰孢Fusarium oxysporum分离于发病甜瓜根系，保存于沈阳农业大学植物保护学院植物免疫研究所。甜瓜种子‘红城５号’购买于苗壮农资公司。

１．１．２培养基

ＰＤＡ培养基：土豆２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂１５～２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。ＰＤＢ培养基：ＰＤＡ 培养基中不加入琼脂。

１．２试验方法

１．２．１纳米铜的生物合成

木霉在ＰＤＡ 培養基上活化后，在菌落边缘打取菌饼转入ＰＤＢ培养基，于转速１２０ｒ／ｍｉｎ，２８℃下培养３～４ｄ，使用无菌Ｗｈａｔｍａｎ１号滤纸过滤并收集发酵液。每１００ｍＬ发酵液加５００μＬＣｕＳＯ，避光条件下静置反应２４ｈ，取３ｍＬ反应液于紫外可见光分光光度计中进行全波长（２００～８００ｎｍ）扫描，综合分析Ｃｕ-ＮＰｓ合成的条件。然后１００００ｒ／ｍｉｎ，离心３０ｍｉｎ收集Ｃｕ-ＮＰｓ，无菌水洗涤２次，７５％乙醇洗涤１次，自然阴干，称重后备用。

１．２．２纳米铜合成条件的优化

１．２．２．１底物ＣｕＳＯ 浓度对合成纳米铜的影响

设置１００ｍＬ反应液中ＣｕＳＯ 的终浓度分别为５．０、１０．０、１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，于３５℃，ｐＨ＝７，避光条件下静置反应２４ｈ，分析反应液中ＣｕＳＯ 浓度对Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影响。

１．２．２．２ ｐＨ 对合成纳米铜的影响

根据１．２．２．１的试验结果，ＣｕＳＯ 浓度设置为１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，反应液的ｐＨ 用１ｍｏｌ／Ｌ ＨＳＯ 和１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ 分别调整为５、７、９、１１，于３５℃，避光条件下静置反应２４ｈ，分析ｐＨ 对ＣｕＮＰｓ合成的影响。

１．２．２．３温度对合成纳米铜的影响

根据１．２．２．１和１．２．２．２的试验结果，将反应液ｐＨ 设为７，ＣｕＳＯ４ 浓度设为１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，分别于３５、４５、５５、６５℃，避光条件下静置反应２４ｈ，分析温度对Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影响。

１．２．３纳米铜粒子的表征分析

透射电子显微镜（ＴＥＭ）观察：将纳米铜水溶液加到覆有碳膜的铜网上，室温干燥，使用透射电子显微镜（ＨＴ７７００，日本）在１００．０ｋＶ 下观察金属纳米粒子的形状和尺寸。

Ｘ射线衍射（ＸＲＤ）观察：在４０ｋＶ 的电压下，以ＣｕＫα１为辐射源，在２θ角为２０°～９０°范围内扫描，用Ｘ射线衍射仪（ＸＰｅｒｔＰｒｏ ＭＰＤ，荷兰）分析合成的纳米铜粒子的晶体结构。

傅立叶红外光谱仪（ＦＴＩＲ）检测：纳米铜粒子以干燥粉末形式与ＫＢｒ混合，压片后暴露于红外，波数范围从４００～４０００ｃｍ－１对其进行傅里叶变换红外光谱（ＦＴＩＲ，Ｎｉｃｏｌｅｔｎｅｘｕｓ４１０，美国）表征检测。

１．２．４纳米铜对尖镰孢的抑制作用

将纳米铜用无菌水配制成１００００ｍｇ／Ｌ的金属纳米粒子溶液，经过超声充分溶解后，加入到ＰＤＡ培养基中，使最终浓度为２００ｍｇ／Ｌ。接入尖镰孢菌饼，２８℃倒置培养７ｄ，测量菌落直径，每处理３个重复。用血球计数法计数每皿中尖镰孢的产孢量［２８］，每处理３个重复。

１．２．５Ｃｕ-ＮＰｓ对甜瓜枯萎病的防效

利用蘸根法接种尖镰孢，当甜瓜幼苗高度约８～１０ｃｍ 时，将甜瓜根部划伤浸于浓度约为１×１０６个／ｍＬ的孢子悬浮液中，１５ｍｉｎ后转移至质量浓度为０、５０、１００ｍｇ／Ｌ和２００ｍｇ／Ｌ的Ｃｕ-ＮＰｓ水溶液中２８℃下培养，５ｄ后观察并记录感病情况。另设无菌水浸泡根部划伤的甜瓜幼苗，并一直在水中培养为空白对照。每处理２０株幼苗，３次重复。按照曲明星等［２９］的方法计算发病率和病情指数。

１．３数据处理与分析

试验数据用Ｅｘｃｅｌ２０１６进行初步整理、分析，用ＳＰＳＳ２１．０进行单因素方差分析（Ｏｎｅ-ｗａｙＡＮＯ-ＶＡ），用Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法进行多重比较，犘＜０．０５（０．０１）表示差异（极）显著。

２结果与分析

２．１纳米铜合成条件的优化

木霉发酵液与ＣｕＳＯ 溶液混合后，铜离子被还原为纳米铜粒子将会发生颜色变化，溶液颜色由橙黄色变为棕绿色，紫外可见光谱分析结果显示，不同反应条件下获得的Ｃｕ-ＮＰｓ的最大吸光度出现在３２５～４２５ｎｍ 之间（图１），说明Ｃｕ-ＮＰｓ能够在不同反应条件下合成，其最大吸收峰出现的位置不同，说明Ｃｕ-ＮＰｓ粒子的大小不同。一般认为吸收峰蓝移，纳米粒子粒径变小［３０］。纳米粒子的粒径越小其抗菌活性越大［１３］。纳米粒子吸收峰越高说明合成的纳米粒子的量越大［３１］。因此，我们在分析Ｃｕ-ＮＰｓ合成条件中将综合这些指标来确定其较优的合成条件。

底物ＣｕＳＯ浓度对木霉发酵液合成ＣｕＮＰｓ的影响见图１ａ。３种浓度下都可合成ＣｕＮＰｓ，但随着底物浓度增加峰值逐渐增高，说明Ｃｕ-ＮＰｓ的合成量增加。在底物浓度为１５ｍｍｏｌ／Ｌ时，吸收峰发生蓝移，说明Ｃｕ-ＮＰｓ的粒径变小，因此，１５ｍｍｏｌ／Ｌ是合成纳米铜的最适浓度。温度对Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影响见图１ｂ。当温度较高时会影响Ｃｕ-ＮＰｓ的合成。３５℃时，紫外吸收峰的峰值较高，且Ｃｕ-ＮＰｓ的特征吸收峰发生蓝移，合成的Ｃｕ-ＮＰｓ粒径较小，因此，３５℃是生物合成纳米铜的最适温度。溶液ｐＨ对Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影响见图１ｃ。强酸或强碱条件都不利于纳米铜粒子的合成。中性条件下形成的峰较窄，ｐＨ９时形成的峰较宽，形成窄峰说明粒径较为均一且粒径较小，形成宽峰说明粒径分布不均且粒径较大，故ｐＨ７为纳米铜合成的最适ｐＨ 条件。

２．２纳米铜粒子的表征分析

为进一步明确合成的纳米铜的形状和大小，利用ＴＥＭ 对合成的Ｃｕ-ＮＰｓ进行表征分析（图２）。结果表明，合成的纳米铜多为球形或伪球形，分散性较好。优化前Ｃｕ-ＮＰｓ的平均粒径约７．８５ｎｍ，优化后的平均粒径约２．４５ｎｍ，说明优化后Ｃｕ-ＮＰｓ粒径变小。

Ｘ射线衍射（ＸＲＤ）分析Ｃｕ-ＮＰｓ的结晶特性表明，２θ角在２０°～８０°之间出现３个强特征衍射峰，对应的２θ值分别为４３．４１°、５０．６５°、７４．６０°，与铜Ｘ 射线衍射卡（ＰＤＦ＃０４ ０８３６）标准图谱吻合，分别对应着（１１１）（２００）（２２０）３个晶面，表明Ｃｕ-ＮＰｓ结构是面心立方结构（图３）。

ＦＴＩＲ分析能夠说明在Ｃｕ-ＮＰｓ合成和稳定化中有生物大分子的参与。ＣｕＮＰｓ的ＦＴＩＲ分析（图３）表明，在３３７９．７０、１６０５．２８、１４０４．３１、１０７８．８３、６１４．７４ｃｍ处出现红外光谱吸收带，其中３３７９．７０ｃｍ吸收峰为酚类和醇类的ＯＨ 的伸缩振动，１６０５．２８ｃｍ是由Ｃ＝Ｏ 化合物的羰基伸缩振动引起的特征峰，１４０４．３１ｃｍ是Ｃ-Ｎ 伸缩振动，１０７８．８３ｃｍ处是Ｃ-Ｏ 伸缩振动，６１４．７４ｃｍ是Ｃ-Ｃ 伸缩振动。由此可推测，木霉的某些代谢物在纳米铜粒子合成过程中起还原作用，同时也可能起到稳定纳米铜粒子的作用。

２．３纳米铜对尖镰孢的抑制作用

长枝木霉合成的Ｃｕ-ＮＰｓ对尖镰孢有明显的抑制作用。由图４可以看出Ｃｕ-ＮＰｓ影响了尖镰孢菌落的生长，虽然菌落的直径没有显著改变，但菌丝稀疏，菌落厚度较薄，产生的分生孢子少。对产孢量计数发现，Ｃｕ-ＮＰｓ显著抑制尖镰孢产孢，对照组产孢量为１．８８×１０个／ｍＬ，而Ｃｕ-ＮＰｓ处理的产孢量仅为为８．７３×１０个／ｍＬ。由此可以看出，Ｃｕ-ＮＰｓ能够抑制尖镰孢菌丝的生长，降低了菌丝量和产孢量。

２．４纳米铜对甜瓜枯萎病的防效

接种尖镰孢后，使用不同浓度的Ｃｕ-ＮＰｓ处理甜瓜苗，调查甜瓜幼苗的发病情况（表１）。结果表明，Ｃｕ-ＮＰｓ能够降低甜瓜枯萎病的发病率和病情指数。Ｃｕ-ＮＰｓ的浓度在５０ｍｇ／Ｌ时，甜瓜的发病率为８６．６７％，病情指数为６３．３３，随着Ｃｕ-ＮＰｓ浓度的增加，发病率和病情指数逐渐降低，当浓度为２００ｍｇ／Ｌ时，发病率降低为５３．３３％，病情指数降低为３３．３３。由此说明，Ｃｕ-ＮＰｓ能够有效缓解甜瓜枯萎病的发病程度。

３结论与讨论

纳米技术在保障粮食安全生产中发挥着关键作用。纳米材料可以用于肥料促进作物生长，提高产量；用于杀虫（菌）剂实现病虫害管理；用于传感器监测土壤质量和植物健康［３２］。纳米材料合成过程中涉及多种化学品和杂质，可能会带入到农业生产资料中，从而对农业系统造成负面影响［３３］，因此，选择低成本、环境友好的生物合成方法是必要的，也是未来纳米技术发展的方向［３４］。本研究选用丝状真菌—长枝木霉生物合成纳米铜，发现长枝木霉能够有效合成纳米铜，合成的Ｃｕ-ＮＰｓ在３２５～４２５ｎｍ处出现特征吸收峰［３５］，较优的合成条件是ＣｕＳＯ 浓度为１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７、温度３５℃。合成的Ｃｕ-ＮＰｓ多呈球形或伪球形，为面心立方结构，平均粒径为２．４５ｎｍ，其表面有多种官能团。纳米铜合成后反应液的颜色由橙黄色转变为棕绿色，颜色的变化是由于纳米粒子溶液中的自由电子被激发，通过与光波共振的Ｃｕ-ＮＰｓ电子振动组合形成表面等离子体共振吸收（ＳＰＲ）带［３６］，从而证实了纳米铜的合成［３７］。优化后合成的Ｃｕ-ＮＰｓ粒子经ＸＲＤ 分析有（１１１）（２００）（２２０）３个晶面，这与Ｖｉｅｔ等［３８］的研究结果一致。ＦＴＩＲ分析表明，木霉代谢产物中游离胺或半胱氨酸等基团与ＮＰｓ结合，起到稳定纳米粒子的作用［３９］。

纳米铜的生物合成受到多种因素的影响，其中ＣｕＳＯ 浓度、反应温度和ｐＨ 是人们常研究的关键因素。研究发现，随着铜离子浓度增大，金属纳米粒子的合成量逐渐增大，超过一定浓度反而下降［４０］，我们的研究结果基本与之相同，较高浓度的ＣｕＳＯ有利于纳米铜的合成，１５ｍｍｏｌ／Ｌ比较适合纳米铜合成。ｐＨ 能够影响金属纳米粒子的形状和大小，納米铜的合成中，中性条件更有利于其合成［４１］，我们的研究结果与其一致。合成温度影响ＣｕＮＰｓ质量和产量，在一定温度范围内，温度升高能够提高纳米铜的合成量，但温度过高反而降低合成量，这可能是温度过高，生物大分子的活性降低或被降解造成的［４０］。我们研究发现，３５℃是合成纳米铜的最佳温度，与Ｅｌ-Ｓａａｄｏｎｙ等［４０］的研究结果一致。因此，底物浓度，溶液ｐＨ 和合成温度均影响纳米粒子的合成，且导致合成的纳米粒子粒径不同。另外，在优化纳米铜合成条件的过程中，也要考虑合成纳米铜的抗菌活性，通过综合评价纳米铜产量及其抗菌活性来选择合成方法。有研究表明，纳米铜和纳米铜前体［琥珀酸铜（Ⅱ）］的抗菌活性是有差异的［４２］，因此有可能合成Ｃｕ-ＮＰｓ和Ｃｕ-ＯＮＰｓ的混合物具有更高的抗菌活性，当然这些还需进一步设计试验来验证。

已有研究表明，纳米铜对茎点霉、链格孢、弯孢菌和尖镰孢等植物病原真菌都具有抗菌活性［２０］，能够抑制这些真菌的生长，我们的研究结果与其基本一致，纳米铜能够抑制尖镰孢菌丝生长，导致菌落稀疏、菌丝纤细，造成产孢量显著减少。Ｒｕｂｉｎａ等［４３］的研究发现，纳米铜对丝核菌犚．狊狅犾犪狀犻也产生同样的效果，产孢量明显减少。纳米铜对甜瓜枯萎病的防效表明，纳米铜能够降低甜瓜枯萎病的发生和病情指数，说明纳米铜可用于植物真菌病害的防治，但由于目前还缺乏系统性研究，造成纳米铜还未真正在病害防治中应用。因此，在系统研究提高纳米铜抗真菌活性的同时，应加强其在病害防治上的研究，以加速其在农业病害防治上的应用，同时还应该研究纳米铜是否对甜瓜生长产生影响，分析纳米铜的生物安全性。