副溶血性弧菌噬菌体在食品中的生物防控研究进展

◎ 郑小双，贡湘磊，谷文成，孙长花，胡 艳，梅 茹

（1.扬州市职业大学，江苏 扬州 225009；2.江苏旅游职业学院 烹饪科技学院，江苏 扬州 225009；3.扬州市农产品智能测控与清洁生产工程技术研究中心，江苏 扬州 225009）

海产品食物中毒的主要原因是食源性致病菌，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）就是一种主要的海洋致病菌，是全世界海产品细菌性食物中毒的主要病原菌。该菌主要存在于动物的表面组织、海底沉积物及海水中，其最大的特点是需盐才能生长，因此海产品中常能分离出此菌。海产品可以为人们提供丰富的动物蛋白质，其需求量逐年增加。人们在食用被该菌污染的水产品后，极易引起急性肠胃炎，通常表现为腹痛、腹泻、发烧和恶心，甚至败血症[1]。

控制食源性致病菌的传统方法有物理（辐射、蒸汽、干热）和化学两种方法[2]，但食品经过这两种方法处理后感官品质会受到影响。热力杀菌技术由于温度高，会使食物的色泽和风味发生明显的变化，食物的营养也会流失。化学消毒剂具有腐蚀性强的特点，会损害食品加工设备。

抗生素是抵御细菌侵染的第一道防线，在水产养殖和畜牧行业发挥着重要作用，但抗生素滥用会导致海产品和环境中耐药细菌和抗性基因的传播。食物中残留的抗生素或被抗生素耐药性病原体污染的食物会严重影响食品安全[3]。部分国家陆续发布了各种抗生素禁令。因此，需要研发替代方法控制海产品中的病原菌，新的生物抑菌剂应该具有安全性高、高效且低廉的特点。

噬菌体是细菌的一种病毒，结构简单，主要由核酸和蛋白质组成，有较强的宿主专一性，不感染哺乳动物细胞，只能侵染特定的一类或一种宿主菌。噬菌体是专门感染和裂解细菌的病毒，其数量庞大，易于筛选，成本低。根据噬菌体增殖方式的不同，可以将噬菌体分为温和噬菌体和烈性噬菌体两类。温和噬菌体的遗传物质能整合到宿主细胞的基因中，不能杀死宿主菌[4]。裂解性噬菌体作用于细菌细胞壁的肽聚糖层导致细菌裂解。噬菌体通过控制食源性病原菌来提高食品安全水平，本文就近年来对副溶血性弧菌噬菌体在食品中的应用进行综述。

1 副溶血性弧菌噬菌体及其应用

1.1 副溶血性弧菌噬菌体

许东勤等[5]对部分国内外报道的副溶血性弧菌噬菌体的特性进行综述，发现这些噬菌体都是有尾的二十面体结构，但是大小不同。噬箘体基因组在2 ～77 kb；噬箘体的最适生长温度为30 ～37 ℃；在30 ～60 ℃能保持热稳定性，pH=4 ～10 具有较高的活性；最佳感染复数随着噬菌体的裂解产生较大差别。副溶血性弧菌噬菌体生长条件的特殊性为噬菌体高效率的裂解宿主菌提供了良好的物理条件。

1.2 副溶血性弧菌噬菌体在减菌方面的应用

副溶血性弧菌是海产品食物中毒的主要致病菌，许多研究人员将噬菌体应用于污染了副溶血性弧菌的海产品、海产品加工设备和器具中，使该菌得到了有效控制。多数研究者报告了新发现的噬菌体，讨论了噬菌体的单一疗法，少数研究者讨论了鸡尾酒疗法、与其他抗菌剂联合使用。已经报道的噬菌体主要来源于湖泊沉积物、海产品养殖场、海水、污水和土壤等环境中。在新鲜食品中分离到的噬菌体相对有限，从食物样本中成功分离到噬菌体的关键取决于宿主菌的浓度，当食物样本中目标细菌浓度较高时有利于噬菌体的分离。

江艳华等[6]探讨了噬菌体VpJYP2 在4 ℃、15 ℃、25 ℃对生三文鱼片中Vp 的控制，4 ℃条件下，在检测7 d内，实验组在8 h未检出菌落，之后也未检出菌落。15 ℃条件下，在检测4 d 内，实验组在8 h 菌落数降至最低，之后菌落数逐渐增加。4 ℃条件下，在检测2 d内，实验组在4 h 菌落数未检出，之后逐渐增加。试验结果显示低温对Vp 的抑菌效果较好，可能是由于在低温条件下Vp 生长缓慢，噬菌体裂解量相对增加。TAN 等[7]从血蛤、虾和冲浪蛤30 份样品中分离出6 株噬菌体。根据宿主范围特异性组合两种噬菌体混合物A（Vp33、Vp22、Vp21和Vp02）和B（Vp08、Vp11）。实验结果显示噬菌体单独使用、两种混合物体外裂解活性效果均显著，37 ℃培养24 h，单个噬菌体减菌量为2.85 ～4.60 lg CFU·mL-1。噬菌体混合物A 和B 减菌量分别为3.69 和4.81 lg CFU·mL-1。LEE 等[8]从牡蛎匀浆中分离出噬菌体VPG01，作用于人工海水中污染细菌的卤虫50 h，卤虫的存活率提高了30%。25 ℃条件下，又研究了VPG01 作为厨房设备和器具生物抑菌剂的可行性，结果发现VPG01 作用在切菜砧板上3 h，细菌数量减少3 个数量级。VPG01（MOI=10）作用在比目鱼肉上6 h，细菌数降至检测线以下水平。该研究将VPG01 和前期分离到的噬菌体VPT02 等量混合来抑制宿主细胞的生长，结果显示两种噬菌体存在拮抗关系，VPG01 或VPT02 单独处理优于混合处理。两者在形态上都是相似的长尾噬菌体科，基因组平均遗传相似度为94.88%，拮抗作用可能是噬菌体重复感染抑制宿主细胞裂解。JANG 等[9]从鱼类和贝类环境的湿沙和沉积物中分离噬菌体BPVP-3325。在液体培养基中处理6 h，实验组OD值明显低于对照组。室温噬菌体在牡蛎肉上应用12 h，细菌数下降约4 lg CFU·g-1。REN 等[10]给海参喂食噬菌体预防和控制副溶血性弧菌，对照组海参存活率＜30%，噬菌体的处理组（MOI=10 和MOI=100）海参存活率提高到80%，并且高于抗生素处理组。AVT 等[11]从贻贝组织中分离出噬菌体KIT04，用不同浓度的噬菌体污染细菌培养物。结果显示，裂解活性与MOI 成正比，MOI为100 时，能抑制细菌生长8 ～9 h。XIA 等[12]评估了F23s1 抑制虾肉中Vp 的能力。25 ℃ F23s1 在12 h内有效抑制细菌的生长，菌落数下降1.92 lg CFU·g-1。YOU 等[13]从牡蛎中分离出噬菌体VPT02，作用于污染Vp 的盐水虾。MOI 为10 的噬菌体使盐水虾存活率从16.7%提高到46.7%。VPT02应用于即食生鱼肉片时，细菌数减少了3.9 lgCFU·g-1。

1.3 副溶血性弧菌噬菌体在控制生物膜方面的应用

YANG 等[14]从污水中分离出噬菌体FE11，不仅能破坏已经形成的生物膜，而且能阻止生物膜的形成，当噬菌体浓度为1010pfu·mL-1时，才能显著破坏形成的生物膜。但是MOI 为0.1 时，能抑制生物膜的形成。YIN 等[15]分离出3 株噬菌体，实验结果显示单一噬菌体和鸡尾酒都能显著性抑制细菌生物膜的形成，但不能去除已经形成的生物膜。研究人员分离到噬菌体采用的原理是噬菌体-宿主相互作用的特异性，噬菌体更有可能出现在其宿主所在的生态环境中。在试验条件下，噬菌体治疗对于防治海产中的副溶血性弧菌有效，但是在侵染晚期，其控制抑菌能力有限。副溶血性弧菌噬菌体的研究方法仍需不断探索和评估，不同地方分离出的噬菌体也存在地域差异。

2 噬菌体治疗优势及目前存在的问题

2.1 噬菌体鸡尾酒的构建注意事项

噬菌体与宿主菌的高度特异性，因此必须鉴定污染的细菌菌株，以便正确应用噬菌体。噬菌体的高度特异性可通过采用较宽宿主范围的噬菌体或噬菌体混合物来扩大宿主范围两种方案来解决。然而，需要确定适宜的噬菌体鸡尾酒宿主范围，因为宽的裂解谱可能会导致抗性菌株的产生或者杀死非目标细菌。混合物中噬菌体数量也应合理选择，过多会增加成本，达不到理想的效果。要避免使用两个基因组相近的噬菌体，当两株基因组相近的噬菌体侵染同一宿主菌时，核酸可能会重组，产生新的噬菌体，新的噬菌体宿主范围和其他特性难以预测。

2.2 噬菌体治疗的优势

噬菌体的宿主特异性是指只能侵染特定的宿主细胞，尤其在胃肠道靶向特定宿主细菌时，因为噬菌体狭窄的宿主范围不会影响其他内源性细菌，对人体无害[16]。噬菌体混合使用减少了抗性菌株的出现、能够区分活细胞与死细胞[17]。噬菌体以指数方式自我复制，能快速裂解宿主细胞。噬菌体在自然界中无处不在，相对容易分离到新的噬菌体用来抵抗新的病原体。

2.3 存在的问题

噬菌体宿主范围较窄，大多数研究发现只能侵染少部分菌株。噬菌体与宿主菌遗传物质相互作用，可能会导致抗性菌株或者新的致病菌株产生。噬菌体目前还未被大众接受，许多国家还未获批其安全性。为了提高噬菌体混合物应用的有效性，还需要优化混合物中每种噬菌体的比例和剂量。噬菌体的生物防控需要根据海产品的种类、目标细菌、噬菌体的保质期制定合理的方案。噬菌体治疗受时间限制，海产品出现症状后，需要花几天时间分离和检测细菌样品，再匹配相应的噬菌体，受污染的海产品可能被摧毁。

3 展望

噬菌体在实验室控制条件下，在体内体外对副溶血性弧菌的控制效果明显，其应用效果受感染复数、治疗方式、环境条件、目标细菌等多种因素影响。噬菌体在食品工业可以应用在不同阶段，如直接作用于动物、植物，也可用于食品工厂生产设备，防止细菌形成生物膜。但是噬菌体在各个领域应用的标准方案、鸡尾酒成分、作用时间与剂量均需要进一步研究[18]。在噬菌体商业化应用之前，需要评估噬菌体处理后海产品的安全性以及大量使用噬菌体后对生态环境的影响[19]。