番茄死秧的病菌鉴定及综合防控措施

孙永生，蒋欣陶，刘爱群，李凌欣，张逸鸣，刘静，王国政*

（1.辽宁省农业科学院蔬菜研究所，辽宁 沈阳 110161；2.葫芦岛市南票区农业农村局农业发展服务中心，辽宁 葫芦岛 125027；3.辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 沈阳 110161）

辽宁地处中国东北地区南部，四季分明，光照充足，昼夜温差适度，非常适合保护地果菜类生产，尤其适合番茄生产。辽宁省番茄种植面积约2.91 万hm2，占辽宁省蔬菜种植面积的32.4%[1]。由于种植模式单调，连作障碍、土传病害逐年加重。同时由于种苗来源广泛，土壤环境恶化，细菌性病害日趋盛行，辽宁省番茄主产区死秧问题呈逐年上升趋势，造成番茄大幅减产，严重影响了番茄种植户的收入和生产积极性。

近年来，辽宁省农业科学院专家采集了省内番茄主产区北票、庄河、黑山、建平、南票、辽中等地的番茄死秧植株，运用镜检，采用病菌分离培养、致病性鉴定和分子鉴定的方法，鉴定造成番茄死秧的主要原因是番茄溃疡病、枯萎病和根腐病以及根结线虫病。研究发现，辽宁地区不同茬口抽样番茄植株发病症状并不一致。越冬茬、早春茬口抽样病株主要是番茄溃疡病，溃疡病的病原菌为密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）。发病植株表现的主要症状是下部叶片首先发病，发病初期叶片边缘出现褐色病斑，并伴有黄色晕圈，随病情加重，病斑颜色加深变为黑褐色，并逐渐向内扩大，导致整个叶片黄化[2]。果实染病，果面出现网状或大理石纹理。

秋延茬口抽样病株死秧的主要原因是番茄枯萎病，其病原菌为尖胞镰刀菌（Fusarium oxysporum）。发病植株表现的症状是植株从近地面的叶序开始发病，逐渐向上蔓延。发病初期，植株中下部叶片出现枯萎，随着病害发生，植株中上部叶片陆续发病，叶片萎蔫但不脱落，直至最后全株叶片枯萎发黄，整株枯死。造成辽宁地区番茄死秧的另一个主要病害就是番茄腐霉根腐病，其病原菌是瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。发病植株的症状是植株茎基部及地面处呈褐色椭圆形病斑，湿度大时，病斑迅速向上、向下扩展，1～2 d 后可绕茎一周，呈灰褐色变软凹陷，病茎上部叶片迅速萎蔫。发病严重时，整个植株萎蔫或枯死。田间湿度大时茎基部呈水渍状腐烂并长出白色絮状霉层，根部变黑、腐烂。

随着病原菌鉴定技术的不断更新，鉴定手段从形态学鉴定到分子生物学鉴定。番茄溃疡病形态学鉴定结果表明，发病初期，叶片边缘或叶脉间有淡绿色斑块，呈水渍状，随后逐渐坏死变干，并扩展至整个叶片。成株期发病，叶片从下至上叶缘褪绿变褐并向上卷曲，随病情发展，叶柄或主茎上产生灰白色至灰褐色条状枯斑，茎部开裂并坏死，剖茎可见髓部中空，维管束褐变，病害扩展缓慢时，病茎略变粗，其表面生出较多不定根或刺状突起，造成全株枯死，但果实未出现“鸟眼斑”；此外，把发病植株的发病部位做成切片，在显微镜下观察，能看到有脓状的液体在显微镜下缓慢移动，据此断定是细菌性病害。本研究分析了番茄死秧的具体原因以及形成番茄死秧问题的一套鉴定体系，为更准确鉴定致病菌类型，还采用序列分析方法进行了分子生物学鉴定，以期为辽宁设施番茄生产中存在的死秧现象提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从辽宁省内主要番茄产区采集番茄溃疡病病叶、病果以及病茎，带回实验室用于后续病菌分离[3]。

营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15～25 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0。

营养肉汤培养基（nutrient broth，NB）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0[4]。

1.2 仪器与设备

电磁炉，SH2128B，广东美的生活电器制造有限公司；DTY-900 型超净工作台、过滤网，北京德天佑科技发展有限公司；摇床，HTS420，上海赫田科学仪器有限公司。

1.3 方法

剪取染病叶片或茎段（坏死组织）病健交界处，置于培养皿内。用75%酒精浸泡30 s，无菌水清洗2 遍，第一遍清洗后倒出无菌水，第二遍加少量无菌水清洗。用剪刀将其在无菌水中剪碎。用无菌接种环（或牙签）在NA培养基表面划线培养。然后置于细菌培养箱中28 ℃培养72 h，当培养基上出现单菌落时挑取单菌落于NB 液体培养基中，于260 r/min 的摇床中28 ℃振荡培养24 h，用无菌水配制成浓度为1×108CFU/mL 的菌悬液，备用。

1.4 致病性的鉴定方法

1.4.1 病原菌的分离

选择播种后培育21～28 d 的2～3 片真叶期番茄幼苗。用打顶法将番茄苗生长点剪断，选取两片较大叶片，用剪刀剪一刀，喷菌悬液，然后保湿，叶片湿度保持在90%以上，以利于发病[5]。接种后14 d 开始观察发病情况，如果接种溃疡病菌的番茄植株均不同程度出现叶片萎蔫变黄、维管束变软、茎坏死、植株死亡等典型细菌性溃疡病症状时，认为此病菌即是番茄死秧的致病菌。如果接种后14～28 d 内没有出现番茄溃疡病的发病症状，认为此病菌不是致病菌，要选择新的单菌落做成菌悬液，重新做致病性鉴定[6]。

1.4.2 致病性的分子鉴定

取致病性鉴定成功后的单菌落，按照Dreier[6]报道的番茄细菌性溃疡病菌一对特异性引物Cmm 5、Cmm 6（引物序列：Cmm 5 为5＇-GCGAATAAGCCCATAT-CAA-3＇；Cmm 6 为5＇CGTCAGGAGGTCGCTA-ATA-3＇），对1.4.1中分离物的菌悬液直接进行PCR 扩增，PCR 反应采用25 μL 体系，包括细菌单菌落，10×PCR 缓冲液（含15 mmol/L Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL（每种dNTP 终浓度为200 μmol/L），10 μmol/L 上下游引物各1 μL（终浓度为200 nmol/L），5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.2 μL，加超纯水至终体积为25 μL。

PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35 次循环；72 ℃延伸5 min。在1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，经溴化乙锭染色后在紫外灯下观测是否得到特异性扩增产物。如果得到特异性扩增产物，认为此病菌即为番茄细菌性溃疡病。

1.5 致病菌的鉴定方法

1.5.1 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃湿热灭菌20 min。

马铃薯蔗糖琼脂培养基（potato sucrose agar，PSA）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃湿热灭菌20 min。

1.5.2 病原菌的分离

将感病的番茄组织（根茎处）用75%酒精擦洗干净，投入3%次氯酸钠溶液中消毒，在病健组织交界处用消毒的解剖刀切取1～2 mm 的病组织小块，然后用无菌水冲洗数次，最后用消毒的镊子将组织小块转移到PDA 培养基上，每个培养皿放一块病样组织块，将培养皿放入28 ℃的培养箱中培养。

1.5.3 致病性鉴定

取适量的番茄种子，用3%次氯酸钠稀溶液浸泡消毒，然后用清水投洗，药剂除干净后，再用50～60 ℃的温水浸种30 min 左右，捞出后用清水浸种，用纱布将种子包好，然后放置到28 ℃的培养箱内催芽，定期投洗，待胚根露出白头后开始播种。将种子播到灭菌的育苗土中，待2～3 片真叶展平时，用浓度为105个孢子/mL 的孢子悬浮液浸根接种，放置到相对湿度大于85%的保湿棚中，7 d 后进行病害调查[7-8]。对发病植株按照柯赫氏法则进行病原菌再次分离与鉴定。

2 结果与分析

2.1 辽宁地区番茄死秧的致病菌确定

一是番茄溃疡病。辽宁省内主要番茄产区采集的番茄溃疡病样，并从中分离获得纯化菌株。根据形态学观察和分子生物学鉴定结果，证实所得菌株均为密执安棒形杆菌密执安亚种（Cmm）。这与其它地区所报道的番茄溃疡病菌一致[7-8]。然而，本鉴定方法采集的样本仅来自辽宁省，存在一定局限性。但引起番茄溃疡病的病原菌并没有生理小种分化，只是致病力有所差异。这与前人的研究基本一致[9-11]。二是番茄枯萎病和根腐病。首先，通过观察植株的表现症状，番茄整株萎蔫，观察近地面茎部腐烂程度，茎基部腐烂初步认定为根腐病，枯萎病茎基部不腐烂，剖开近地面的茎，如果维管束变褐，初步认定是枯萎病，枯萎病只有近地面部分维管束变褐而不是整个植株维管束都变褐。然后通过显微镜镜检认定是镰刀菌，最后通过形态学和分子鉴定。

2.2 辽宁地区番茄死秧致病菌的致病性

2.2.1 病原菌的形态观察

发病菌株在PDA 培养基上25 ℃培养5 d，挑取菌丝转移至PSA 培养基25 ℃培养，4 d 后观察菌落形态及颜色的变化，记录菌落直径；观察大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形状及着生方式，产孢细胞形态特征，分生孢子座的产生等情况，测量30～50 个大型分生孢子和小型分生孢子的长度和宽度[12-13]。

2.2.2 病原菌及病害的鉴定

（1）形态学鉴定

发病菌丝在PSA 培养基上培养4 d 后，菌落平均直径为4.0 cm，菌株间存在差异，气生菌丝绒状或毡状，白色或粉色，常带有紫色或红色。小型分生孢子较多，卵形或肾形，0～1 个隔膜，假头状着生在产孢细胞上，大小5～11.5 μm×2～4 μm。大型分生孢子美丽型，较匀称，基细胞足跟明显，多数为3～4 个隔膜，大小13～38 μm×2.3～4.5 μm。厚垣孢子顶生或串生，球形。产孢细胞单瓶梗，较短，单生或具分枝。表现出尖孢镰刀菌的特征，初步鉴定为番茄枯萎病。

如果发病菌丝在PSA 培养基上培养4 d 后，菌落平均直径为3.9 cm，气生菌丝较少，薄绒状，白色至浅灰色；背面在菌落中心形成褐色。小型分生孢子数量多，假头状着生，卵形或肾形，大小5.5～11 μm×2.2～4 μm。大型分生孢子马特型，两端较钝，顶胞稍弯。2～8 个隔膜，大小10～60 μm×3～4.9 μm。厚垣孢子球形，单生、对生、顶生或串生。产孢细胞较长，长筒形，单瓶梗，大多数瓶梗长于50 μm，可达到200 μm。可产生土黄色分生孢子座。表现出茄病镰刀菌的特征，初步鉴定为番茄根腐病。

（2）分子鉴定

选取51 株代表菌株进行分子鉴定。采用CTAB 法提取菌株基因组DNA。利用真菌核糖体基因内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS1 和ITS4 进行PCR 扩增。反应体系为50 μL：模板DNA 2 μL（10～50 μg/L），ITS1 和ITS4 引物各1 μL（10 μmol/L），Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，送测序公司测序。通过NCBI 核酸数据中的BLAST 程序，提交测定得到的ITS-r DNA 序列与GENBANK 中核酸序列进行比对，对经形态鉴定的种类进行分子验证[14]，进而鉴定为番茄枯萎病和根腐病。

3 番茄死秧的综合防控措施

3.1 选用抗病或耐病品种

选用抗病或耐病品种是植物病害防治最经济有效的途径之一。选择抗枯萎病和根腐病的番茄品种，如‘维也纳F1’‘奥地利2 号’‘吉丽2 号’‘罗拉’等。

3.2 种子消毒

种子消毒是防治番茄溃疡病的有效途径之一。先把种子放在35～38 ℃温水预热8～10 min，后放在55 ℃热水浸种30 min，待水温下降到室温再浸泡20 min，清洗干净，于25～28 ℃恒温箱催芽；或用0.5%的消毒剂1 号浸泡种子1 h，捞出后用清水冲洗30 min 后播种；或用3%次氯酸钠浸种20 min 后用清水洗净药液，稍晾干后再催芽播种。

3.3 药剂防治

在定植时，使用防治镰刀菌和细菌的药剂蘸根或灌根，可选用甲霜·噁霉灵加四霉素灌根或者咯菌腈加硫酸铜钙灌根。定植后10～15 d 使用以上药剂灌根一次。定植后25～30 d 使用以上药剂再灌根一次，防治效果非常好。

根结线虫可以通过对不同杀线虫药剂单剂和复配药剂的筛选，筛选出辽宁地区防治线虫效果比较好的药剂是41.7%氟吡菌酰胺（路富达）、5%氟铃脲+30%噻虫胺、3%辛硫磷+5%阿维菌素。

3.4 培育健壮植株

培育健壮植株是解决土传病害的一种常见方法，也是植株抵御外界病原菌侵染的一种有效方法[15]。从蔬菜栽培角度，防治病害最实用的方法就是培育健壮植株，提高植株免疫力。首先要培育健壮的苗，其次是培养发达的根系，最后在植株生长期调节好茎叶和果实之间的平衡生长。

3.5 嫁接

嫁接是防治土传病害最主要的措施之一[16-18]。选择抗镰刀菌的番茄砧木嫁接可以降低枯萎病和根腐病的发生。由于番茄嫁接常用的砧木是番茄，筛选抗病砧木比较困难，嫁接成本也高，所以番茄嫁接技术在辽宁省内应用并不广泛。

3.6 土壤消毒

土壤消毒是防治土传病害、细菌性病害和根结线虫的重要方式。目前生产中比较常用的土壤消毒剂是氰胺化钙、棉隆和威百亩。氰氨化钙作为一种高效的土壤消毒剂，可有效地防治镰刀菌属引起的番茄枯萎病、根腐病和线虫。棉隆是一种光谱性的土壤熏蒸、消毒剂，低毒、使用范围广，在土壤中能分解出异硫氰酸甲酯、甲醛和硫化氢等，这些气体能迅速扩散至土壤团粒间，能杀灭土壤中的细菌、真菌和线虫。威百亩是一种低毒、高效、使用范围广的农药，在土壤中降解产生异硫氰酸甲酯，能有效杀灭土壤中的真菌、细菌和线虫[19]。使用氰氨化钙和棉隆熏蒸消毒时，注意浇水不易过多，土壤含水量60%～70%即可，土壤含水量过多，气体在土壤里不易流动，影响消毒效果。土壤消毒还需要尽量提高棚内温度和土壤温度、延长消毒时间，提高土壤消毒剂的利用率和使用效果。

3.7 施用生防菌剂

生防菌剂作为一种环境友好型的防治土传病害的方法，已经在生产中被广泛的应用。目前辽宁地区生产中应用比较多的是荧光假单胞杆菌500～670 g/667 m2，M22 枯草芽孢杆菌500 g/667 m2[20]，哈茨木霉菌T～22 用量1 000 g/667m2，l0 亿孢子枯草芽孢杆菌可湿性粉剂500 倍液灌根。

4 小结

番茄死秧问题已成为阻碍辽宁省设施番茄产业发展的主要问题之一，部分地区、部分番茄种植户谈番茄色变，遇到番茄死秧，束手无策。辽宁省农业科学院蔬菜栽培、植物保护、土壤与肥料专家联合攻关，对辽宁省番茄死秧问题进行了细致的研究与分析，基本摸清了辽宁省番茄死秧的主要原因，并提出了科学的防治方法。解决辽宁地区番茄死秧问题，重在通过选择抗病品种、种子消毒，定植后的药剂防治、培育健壮植株、选择抗病砧木嫁接、土壤消毒及有效利用生防菌剂的综合防治措施。