PD-1抗体调节糖尿病大鼠CD8+T细胞和Treg平衡促进糖尿病足溃疡愈合的疗效研究

黄亚莲 刘莹 赖舒畅 符茂雄

[摘要]目的：探討PD-1抗体治疗糖尿病大鼠足溃疡的疗效及其作用机制。方法：将30只6～8周龄健康Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组10只，三组大鼠足部人为造成溃疡创口。采用流式细胞术计数三组大鼠脾脏中CD8+T细胞和调节性T细胞；Image J对创口照片进行分析计算伤口愈合率；HE染色和组织病理学分析溃疡创口处皮肤愈合情况；ELISA测定大鼠足部溃疡创口组织中TNF-α和IL-1β的水平。结果：与对照组相比，模型组大鼠CD8+T细胞计数明显下调，Treg细胞计数明显升高（P＜0.05）；模型组大鼠足部溃疡创口愈合不佳，没有形成完整的新生表皮组织和肉芽组织，未见胶原沉积；模型组大鼠创口处组织中TNF-α和IL-1β的水平明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，治疗组大鼠CD8+T细胞计数明显回升，Treg细胞计数明显回落（P＜0.05）；治疗组大鼠足部溃疡创口愈合良好，有较为完整的新生表皮组织、肉芽组织和一定的胶原沉积；治疗组大鼠创口处组织中TNF-α和IL-1β的水平明显降低（P＜0.05）。结论：应用人源化PD-1抗体治疗糖尿病大鼠足溃疡具有明显的疗效。

[关键词]糖尿病足溃疡；PD-1抗体；CD8+T细胞；调节性T细胞；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β

[中图分类号]R587.2    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）06-0094-04

Efficacy of PD-1 Antibody Regulating the Balance of CD8+T Cells and Treg Cells in Diabetic Rats and Promoting the Healing of Diabetic Foot Ulcers

HUANG Yalian1，LIU Ying2，LAI Shuchang1，FU Maoxiong1

（1.Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570311，Hainan ，China; 2.Drug Safety Assessment Center of Hainan Medical College，Haikou 570216，Hainan，China）

Abstract： Objective  To investigate the efficacy and mechanism of PD-1 antibody in the treatment of diabetic foot ulceration in rat model. Methods  30 Rats were randomly divided into control group， model group and treatment group， each group has 10 rats， artificial ulcer wounds on the feet of three groups of rats. Flow cytometry was used to count CD8+T cells and regulatory T cells （Treg） cells in the spleens of the three groups of rats. Image J was used to analyze wound photos and calculate wound healing rates. HE staining and histopathological analysis was used to analyze ulcer wounds healing. ELISA was used to determine the levels of TNF-α and IL-1β in rats foot ulcer wound tissues. Results  Compared with the control group， the CD8+T cell count in the model group was significantly down-regulated， and the Treg cell count was significantly increased （P＜0.05）. The wounds of the foot ulcers of the rats in the model group did not heal well with no complete structure of new epidermal tissue and granulation tissue were formed， and no collagen deposition was found. The levels of TNF-α and IL-1β in the wound tissue of rats in the model group were significantly increased （P＜0.05）. Compared with the model group， the CD8+T cell count in the treatment group increased significantly， and the Treg cell count decreased significantly （P＜0.05）. The wounds of the foot ulcers of the rats in the treatment group healed well， with relatively complete structure of new epidermal tissue and granulation tissue were formed， and certain collagen deposition was found. The levels of TNF-α and IL-1β in the wound tissues of the rats in the treatment group were significantly decreased （P＜0.05）. Conclusion  The application of humanized PD-1 antibody in the treatment of diabetic rat foot ulcer has good curative efficacy.

Key words： diabetic foot ulcer; PD-1 antibody; CD8+ T cells; Treg cells; tumor necrosis factor-α; interleukin-1β

炎症的反应性和耐受性之间的精细平衡主要由T细胞调节，同时还受细胞间相互作用和细胞因子控制。在动物模型中，CD8+T细胞具有促进炎症反应和促进创伤愈合的双重功能；与之相对比的是，调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg）具有抑制CD8+T细胞的功能[1-3]。已有研究显示，在糖尿病患者中观察到其外周血Treg细胞数量明显上升[4]。T细胞上表达的PD-1与其配体PD-L1相互作用，在调节T细胞分化和免疫耐受性过程中发挥关键作用[5]。本次研究拟通过给予PD-1抗体治疗，探讨此疗法对糖尿病大鼠CD8+T细胞和Treg之间平衡的影响及其对糖尿病足溃疡愈合是否能够产生积极作用。

1  材料和方法

1.1 实验材料：30只6～8周龄健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，购自海南药物研究所有限责任公司。标准啮齿类动物饲料和60 kcal的高脂饮食（HFD）购自MP Biomedicals（美国）公司。硫喷妥钠购自上海源叶生物（中国）。抗大鼠CD16/32抗体（ab223200）购自Abcam（美国）。PE标记的抗大鼠CD8a抗体（87922），PE标记的抗大鼠Foxp3抗体（65210）和APC标记的抗大鼠CD25抗体（36055）购自CST（英国）。蛋白酶抑制剂（539134）购自Sigma-Aldrich（美国）。TNF-α（CSB-E11987r）和IL-1β（CSB-E08055r）ELISA试剂盒购自武汉华美生物（中国）。流式细胞仪（FACS Aria Ⅲ）购自美国BD公司，光学显微镜（ECLIPSE Ni-E）购自日本Nikon公司。

1.2 实验动物：30只6～8周龄健康SD大鼠，体质量（160±30）g，饲养于标准SPF级鼠房，恒温[（23±2）℃]恒湿，具备以12 h为周期的光照/黑暗循环，每3只大鼠一个鼠笼。大鼠开始饲喂HFD饮食构建糖尿病大鼠模型前，在鼠房预先适应性饲养1周。适应性饲养期间，所有大鼠喂食标准啮齿类动物饲料，大鼠可以自由饮水和进食。所有动物实验均通过医院伦理委员会批准，批准文号为202109-08。

1.3 构建糖尿病大鼠模型：将大鼠随机分为3组，分别为对照组（n=10），2型糖尿病模型组（n=10），给予PD-1抗体治疗的治疗组（n=10）。对照组喂食标准啮齿类动物饲料，模型组和治疗组大鼠持续喂食8周的高脂饮食（HFD），然后令大鼠禁食过夜，次日9时对其腹腔注射链脲佐菌素（35 mg/kg），随后喂食4周标准啮齿类动物饲料，使大鼠发展为2型糖尿病。

1.4 产生糖尿病足部溃疡：麻醉各分组大鼠（50 mg/kg硫喷妥钠）后，使用手术剪和6 mm穿刺活检器械在大鼠后足背部形成足部溃疡创口。大鼠足部形成溃疡创口后，治疗组从形成溃疡创口的第0天开始，每隔1 d腹腔注射一次人源化的PD-1抗体（4 mg/kg 100 ?l），共注射4次；在治疗组注射PD-1抗体的同一天，对照组和模型组大鼠腹腔注射100 ?l无菌生理盐水。

1.5 足部溃疡创口愈合率的计算：在形成创口后每隔24 h，用数码相机对伤口进行拍照，然后使用ImageJ v1.8.0软件分析伤口大小。伤口愈合百分比（%）=（初创口面积-测量当天伤口面积）/最初创口面积×100%。足部创面愈合第7天，拍照记录创面后，向大鼠腹腔注射过量硫喷妥钠（80 mg/kg）对其进行安乐死。取大鼠足部创面处皮肤組织进行后续HE染色和病理学分析。

1.6 流式细胞

1.6.1 分离大鼠脾脏淋巴细胞：足部创面愈合第7天，手术摘取大鼠脾脏。然后将新鲜分离的大鼠脾脏置于冰预冷的无菌PBS缓冲液中，将脾脏用无菌手术刀切成2 mm3的组织小块。同样在无菌条件下，将组织小块放置于70μm细胞筛网的上面，使用组织研磨棒挤压摩擦组织，使细胞通过70μm细胞筛网制备单细胞悬液。用冰预冷的无菌PBS缓冲液冲洗组织，收集通过筛网的单细胞悬液。合并上述单细胞悬液，以1 500 rpm，于4℃离心5 min，收集细胞沉淀，即为脾脏淋巴细胞。

1.6.2 流式细胞术检测CD8+T细胞和Treg细胞：重悬并计数脾脏淋巴细胞悬液，加入冰预冷的PBS调整细胞悬液，使悬液的细胞浓度为1×105个/毫升。将细胞悬液置于冰上，并加入抗大鼠CD16/32抗体封闭30 min。对于CD8+T细胞检测，加入PE标记的抗大鼠CD8a抗体，置于冰上避光孵育1 h。对于Treg细胞检测，加入PE标记的抗大鼠-Foxp3抗体和APC标记的抗大鼠CD25抗体，置于冰上避光孵育1 h。上机BD流式细胞仪进行分析。

1.6.3 HE染色和病理学分析：收集大鼠足部创口皮肤组织（每组5只），立即浸入10%中性福尔马林固定液中，在4℃下固定组织超过48 h，待组织充分固定后，经石蜡包埋，然后切成厚度为5μm的切片。切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，然后使用苏木精染色液染细胞核，使用1%的盐酸乙醇进行分化，再使用伊红染色液染细胞质。最后自来水冲洗去除多余染色液，中性树胶封片，Nikon光学显微镜下镜检。

1.7 ELISA：收集大鼠足部创口皮肤组织（每组5只），立即使用液氮对组织速冻，并在液氮中制备组织匀浆。然后向每份组织匀浆，加入1 ml冰预冷的含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，以12 000 rpm，于4℃离心15 min，收集上清液。上清液置于冰上，使用大鼠TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒测定创口皮肤组织匀浆中的TNF-α和IL-1β的水平，具体实验操作方法根据试剂盒说明书进行。

1.8 统计学分析：数据均以平均值±标准差（x ?±s）的形式表示。使用GraphPad Prism v8软件对数据进行统计学分析。三组间比较，采用单向方差分析。以P＜0.05为组间差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 PD-1抗体能够调节糖尿病大鼠脾脏CD8+T细胞和Treg平衡：与对照组大鼠相比，模型组大鼠脾脏中CD8+T细胞的比例明显下降，而Treg细胞的比例明显上升（P＜0.05）；而经过PD-1抗体治疗后，与模型组大鼠相比，治疗组大鼠脾脏中CD8+T细胞的比例明显回升，而Treg细胞的比例明显下降（P＜0.05）。见图1。

2.2 PD-1抗体能够促进糖尿病足溃疡愈合：经过7 d的愈合，对照组大鼠愈合了约51.30%，而模型组大鼠仅愈合了约33.70%，显著低于对照组（P＜0.05）；给予PD-1治疗的治疗组大鼠溃疡愈合了约45.50%，显著高于模型组（P＜0.05）。对愈合了7 d的大鼠足部溃疡组织进行HE染色和病理学分析，可见对照组和治疗组溃疡处有较为完整的新生表皮组织、肉芽组织和一定的胶原沉积，而模型组溃疡处无完整的新生表皮组织和肉芽组织，未见胶原沉积。见图2。

2.3 PD-1抗体能够抑制糖尿病足溃疡处TNF-α和IL-1β的表达：结果显示与对照组相比，模型组大鼠足部溃疡组织处炎症因子TNF-α和IL-1β的水平显著升高（P＜0.05），而给予PD-1治疗的治疗组大鼠足部溃疡处炎症因子水平明显较低，显著低于模型组大鼠（P＜0.05）。见图3。

3  讨论

糖尿病的患病率在全球范围内以惊人的速度增长。下肢截肢是糖尿病相关发病率和死亡率高的主要原因之一，是糖尿病足溃疡（Diabetic foot ulceration，DFU）的结果[6-7]。与正常个体伤口愈合的过程相比，慢性糖尿病患者的伤口愈合过程缓慢甚至无法愈合。这种愈合缺陷是由糖尿病相关的神经病变、微血管病变和免疫功能障碍造成的[8-9]。糖尿病患者呈现出全身性炎症环境，白细胞介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α的水平持续高于正常个体[10]。在本次研究结果中也发现，与对照组相比，模型组大鼠足部溃疡组织处炎症因子TNF-α和IL-1β的水平显著升高（P＜0.05），这与前人研究结果一致。TNF-α糖尿病患者外周血中的水平高于正常健康个体[11]。多种糖尿病足的针对性疗法都旨在降低患者足部组织中TNF-α等炎症因子的水平[11-12]。NLRP3炎症小体促进IL-1β的分泌介导2型糖尿病患者的全身性炎症反应越来越受到研究者的重视[13]。二甲双胍能够抑制NLRP3炎症小体和IL-1β的水平发挥保护2型糖尿病心肌病的作用[14]。而且这种炎症环境将延伸到皮肤等各种其他组织，造成糖尿病患者免疫系统功能紊乱，出现抗菌能力被抑制和对组织再生无法作出有效免疫应答的现象[15-16]。因此，全身性高炎症水平引起的免疫功能紊乱是一个核心问题，单方面仅针对性地降低足部组织的炎症水平，无法从根本上解决DFU的病因，也就无法达到彻底治愈DFU的目标。

众所周知，CD8+T细胞介导的免疫反应在器官和组织损伤后的伤口愈合过程中扮演着双重调节的重要角色[17-18]。CD8+T细胞缺乏将导致心机梗死小鼠心肌坏死面积扩大、瘢痕形成不良和心脏破裂风险增加[17]。有研究显示，DFU患者外周血中，幼稚T细胞数量和T细胞受体（T cell receptors，TCRs）多样性降低，效应性T细胞（Effector T cells）大量扩增[19]，高血糖降低效应性CD8+T细胞的抗病毒功能[20]。在本次的研究结果中显示，与对照组相比，模型组大鼠脾脏CD8+T细胞数量发生了明显的降低，Treg细胞的數量明显升高。同时，模型组大鼠足部溃疡的伤口愈合能力明显低于对照组。有研究显示二甲双胍能够促进记忆样抗原-缺乏的CD8+、CXCR3+T细胞群的扩增，从而增强2型糖尿病患者或模型小鼠对结核分枝杆菌攻击的抵抗能力[21]。综合这些结果可以猜测，在本次研究的模型组大鼠体内，某些亚型的免疫细胞（Treg）被过度激活，而CD8+T细胞则发生了耗竭，导致模型组大鼠溃疡处免疫反应能力降低，伤口愈合不良。

已知PD-1在常规CD4+T细胞、CD8+T细胞以及Treg细胞上被诱导表达[22]。PD-1/PD-L1在肿瘤治疗中已被用来调节和改善患者免疫系统活性。PD-1抑制剂可用以调节2型糖尿病患者的T细胞衰竭[23]。而在本次研究中，向糖尿病大鼠腹腔注射人源化PD-1抗体进行治疗，试图探索阻滞PD-1/PD-L1信号是否能够缓解糖尿病大鼠过度活化的Treg细胞，改善糖尿病足溃疡的免疫功能缺陷状态。结果显示，与模型组相比，给予PD-1抗体治疗后的治疗组大鼠，CD8+T细胞明显回升，说明CD8+T细胞耗竭得到了缓解；同时，Treg细胞数量也明显回落。进一步地对对照组、模型组和治疗组大鼠的糖尿病足溃疡组织进行了HE染色和病理学分析结果显示，与模型组相比，治疗组大鼠的溃疡创口明显长出新生表皮组织和肉芽组织，伤口愈合程度明显好于模型组。这一结果说明，腹腔注射PD-1抗体，能够阻滞Treg细胞表面PD-1的免疫调节信号，使其调节免疫反应和促进组织再生过程中发挥更为积极的作用。

高血糖不仅可以引起大血管、微血管病变，导致新生血管发生障碍，还能在慢性炎症的持续过程中，通过组织中高水平的TNF-α和IL-1β激活基质金属蛋白酶，破坏组织的基底膜，导致破损的组织难以愈合[24]。根据ELISA结果显示，与模型组相比，治疗组大鼠创口处TNF-α和IL-1β的水平明显降低。这很有可能是因为过度活化的Treg细胞被有力抑制后，其调节免疫反应的方向由促炎性免疫反应转向了抑制炎症和促进伤口愈合的方向，具体表现为TNF-α和IL-1β的分泌水平的下降。这一结果进一步说明了PD-1抗体在治疗糖尿病足溃疡中具有积极的作用。

盡管在本次研究中，未对模型组和治疗组大鼠脾脏中各种分化后的T细胞类型进行全面检测，以探讨PD-1抗体治疗对幼稚T细胞分化的具体影响，及这种影响是否会作用于糖尿病足溃疡的愈合过程。但本研究的结果初步显示了DP-1抗体治疗糖尿病大鼠模型足部溃疡的价值。同时，由于人源化PD-1抗体在肿瘤治疗中的广泛应用，其安全性也得到了肯定，进一步将其应用于治疗糖尿病足溃疡，具有很大的临床应用潜力。总之，本次研究初步证明，应用人源化PD-1抗体能够明显升高糖尿病大鼠模型的CD8+T细胞、下调Treg细胞数量，抑制足部溃疡处TNF-α和IL-1β的分泌并促进创口愈合。

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[收稿日期]2022-07-11

本文引用格式：黃亚莲，刘莹，赖舒畅，等.PD-1抗体调节糖尿病大鼠CD8+T细胞和Treg平衡促进糖尿病足溃疡愈合的疗效研究[J].中国美容医学，2023，32（6）：94-98.