分散固相萃取-GC-MS/MS 法同时检测卷烟主流烟气中21 种酰胺类化合物

潘立宁，刘瑞红，秦亚琼，王晓瑜，王 冰，陈满堂，郭军伟，崔华鹏，余晶晶，樊美娟，刘绍锋

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

卷烟烟气中的化学成分通过嗅觉、味觉和化学感觉引起吸烟者生理感觉发生变化，研究感官相关关键化学成分有助于定向设计卷烟产品，提升感官舒适性［1］。酰胺类化合物是一类重要的感官相关物质。雷诺公司将多年来积累的烟草制品调香数据归纳总结，出版了《Tobacco flavoring for smoking products》［2-3］一书，涵盖酰胺、有机酸、氨基酸、醇、酚、醛、酮、酯和碱性化合物等18类化学成分的感官特征。其中，涉及19 种酰胺类化合物，均为味觉成分，4种为嗅觉成分，7种为化学感觉成分；大部分酰胺类化合物产生霉味、粗糙和辛辣等感官影响，少数具有甜香和烤香等感官特征。王丁众等［4］基于感官导向技术对卷烟烟气关键化学成分进行研究鉴定，其中4种酰胺类化合物被认为是卷烟烟气中的重要苦味特征成分。鉴于酰胺类化合物对卷烟感官特征的重要影响，准确检测卷烟烟气中酰胺释放量并对其释放特征进行研究具有重要的意义。然而，目前关于卷烟烟气中酰胺类化合物的分析研究主要针对有害酰胺成分（甲酰胺、丙烯酰胺等）［5-9］，对于与感官相关酰胺类化合物的分析检测尚未见报道。2013年，王冰等［6］建立了测定卷烟主流烟气中丙烯酰胺的LC-MS/MS 法，用滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物，以去离子水为溶剂超声萃取，用乙腈稀释后直接进样。2022年，Esposito等［9］使用一种与真空源相连并带有气流控制器的装置，在装置中加入去离子水收集烟气总粒相物，经溴化衍生后，采用乙酸乙酯-正己烷混合溶剂萃取并浓缩，GC-MS联用仪分析测定卷烟烟气中的丙烯酰胺。

卷烟烟气基质十分复杂［10］，净化基质可增强方法的抗杂质干扰能力，减少样品基质对仪器的污染，提高定性和定量分析的准确度。分散固相萃取是将适量的净化剂直接加入提取液中，尽可能地吸附杂质并保留目标物，具有简便和快速的特点［11-15］。相对于传统的固相萃取，无需使用大量有机溶剂进行洗脱，也无需进行后续浓缩操作，环境友好、定量准确度高。因此，本研究中采用分散固相萃取技术对烟气基质进行净化，采用GC-MS/MS法建立了同时检测卷烟主流烟气中感官相关酰胺类化合物的分析方法，研究了其在卷烟烟气中的气粒相分布和释放量水平，并初步分析了影响释放量的因素，旨在为卷烟品质提升提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

12个市售卷烟样品的详细信息见表1，包括6个烤烟型和6 个混合型卷烟，盒标焦油释放量范围为1~11 mg，卷烟滤嘴有醋纤、活性炭和复合滤嘴3 种类型，其中，样品4、5 和12 为进口卷烟，其余为国产卷烟；为了保证所建立前处理方法的适用性，选用高焦油释放量卷烟（实验室自制的烤烟型卷烟，实测TPM为15 mg，醋纤滤嘴）进行条件优化实验。

表1 市售卷烟样品信息Tab.1 Information of commercial cigarette samples

XAD-4 吸附管（80/40 mg，ORBOTM-613）、石墨化炭黑（粒径180~250 µm，carbopackTMB，美国Supelco 公司）；PSA 吸附剂、C18吸附剂（粒径40~63µm，德国CNW公司）；有机相滤膜（孔径0.22 μm，上海安谱公司）；DB-624 熔融石英毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×1.4 µm）、DB-Waxetr 熔融石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）（美国Agilent 公司）；剑桥滤片（直径44 mm，德国Borgwaldt公司）。

甲醇（99.9%）、乙腈（99.9%）、丙酮（99.9%）（北京迪科马科技有限公司）；二氯甲烷（99.9%，美国J T Baker公司）；三乙胺（99%，北京百灵威科技有限公司）；超纯水（自制，电阻率18.2 MΩ·cm）。

标准品：异丁酰胺（99%）、异戊酰胺（98%）、糠酰胺（97%）（英国Alfa Aesar公司）；乙酰胺（99.4%）、烟酰胺（99.3%）、丙烯酰胺（99.3%）（德国Dr Ehrenstorfer 公司）；甲酰胺（99.5%）、N-甲酰基吡咯烷（97%）（德国Sigma 公司）；丙酰胺（98%）、N-乙酰基吡咯烷（97%）、N-甲基烟酰胺（98%）、N-乙基烟酰胺（98%）、4-甲基-3-乙基-3-吡咯啉-2-酮（98%）（日本TCI 公司）；1H-吡咯-2-甲酰胺、氘代丙烯酰胺、氘代烟酰胺（98%，北京百灵威科技有限公司）；N-丙酰基吡咯烷、N-丁酰基吡咯烷、N-异丁酰基吡咯烷、N-异戊酰基吡咯烷、N-巴豆酰基吡咯烷、N-癸酰基吡咯烷、N-肉豆蔻酰基吡咯烷（95%，深圳爱拓化学有限公司）；氘代乙酰胺（99%，加拿大CDN公司）。

trace1310/TSQ QUANTUM XLS 气相色谱-串联质谱联用仪（美国Thermo Scientific 公司）；SM450-PC107 直线型吸烟机（英国Cerulean 公司）；KQ-700DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP2245 电子天平（感量0.000 01 g，德国Sartorius 公司）；Milli-Q50 超纯水仪（美国Millipore公司）；HY-8调速振荡器（常州国华电器有限公司）；Multi Reax涡旋振荡器（德国Heidolph公司）。

1.2 方法

1.2.1 卷烟样品准备及烟气捕集

将卷烟样品在（22±1）℃、相对湿度60%±2%的环境中平衡48 h，挑选（平均质量±0.015）g 和（平均吸阻±49）Pa的烟支进行测试。

用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气粒相物，参照GB/T 16450—2004［16］中的条件抽吸卷烟，卷烟抽吸支数为8支。

1.2.2 前处理方法

卷烟抽吸结束后，迅速将剑桥滤片转移至15 mL 离心管中，加入20 μL 混合内标工作液，加入8 mL 萃取剂（200 μg/mL 三乙胺的甲醇溶液），以2 000 r/min 涡旋5 min。移取1 mL 提取液至2 mL 离心管中，加入50 mg 石墨化炭黑（Graphitized carbon black，GCB），以2 000 r/min 涡旋5 min，然后以8 000 r/min离心3 min，取上清液，过有机相滤膜，然后进行GC-MS/MS分析。分析条件：

色谱柱：DB-Waxetr 熔融石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样方式：脉冲不分流，脉冲压力200 kPa；进样口温度：240 ℃；进样量：1 μL；载气：氦气，恒流流速1 mL/min；升温程序：50 ℃（1；传输线温度：230 ℃。电离方式：EI；溶剂延迟：7 min；离子源温度：280 ℃；灯丝发射电流：50 μA；碰撞气：氩气，压力0.133 Pa；扫描方式：多反应监测（MRM）。

1.2.3 标准工作溶液配制及标准曲线建立

混合内标工作溶液：准确称取10 mg 的氘代乙酰胺、氘代丙烯酰胺、氘代烟酰胺，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 µg/mL 的混合内标储备液；然后采用甲醇稀释，配制成100µg/mL 的内标工作溶液。

单一标准储备液：准确称取21 种酰胺类化合物各10 mg，分别置于不同的10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成浓度均为1 000 μg/mL 的标准储备液。

一级混合标准溶液：移取1 mL各单一标准储备液至100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，各目标物浓度均为10 μg/mL。

标准工作溶液：分别移取一级混合标准溶液2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μL，置于不同的10 mL棕色容量瓶中，再分别准确加入25 μL混合内标工作液，用甲醇定容，各目标物浓度分别为2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL，内标浓度均为250 ng/mL。

根据实际卷烟样品酰胺类化合物释放量选取7个合适的质量浓度点，以目标物与内标物峰面积比（Y）对质量浓度比（X）进行线性回归，得到各目标物的标准工作曲线及相关系数。

2 结果与讨论

2.1 目标物的选取

对《Tobacco flavoring for smoking products》［2-3］一书中用于烟草调香的酰胺类化合物以及王丁众等［4］报道的基于感官导向技术所鉴定的烟气中的酰胺类成分进行梳理，同时将烟草行业内外重点关注的烟气有害酰胺成分（甲酰胺、丙烯酰胺）纳入研究范围，共选取了21种酰胺类化合物作为目标物（删除了因沸点极高而不适于GC 分析的酰胺），详细信息见表2。其中，19 种酰胺类化合物为感官相关成分，2 种为有害成分（甲酰胺具有生殖毒性，是欧洲REACH法规高度关注物质；丙烯酰胺被列于Hoffmann名单中，属于IARC 中2A 类致癌物）。感官相关成分中，19 种均为味觉成分，2 种为嗅觉成分，6 种为化学感觉成分。有15种酰胺类化合物产生霉味、粗糙和辛辣等感官影响，4种具有甜香和烤香等感官特征。

表2 21种酰胺类化合物的感官特征Tab.2 Sensory characteristics of 21 amide compounds

2.2 仪器条件的确定

2.2.1 色谱柱选择

良好的色谱峰形有利于目标物与杂质、背景噪音的区分，有助于准确积分，从而提高定性分析的可靠性、定量分析的灵敏度和准确度。选择与目标物性质匹配的色谱柱，以获取对称的色谱峰。由于分子结构中酰胺基团的存在，酰胺类化合物具有一定极性，但不同取代基的酰胺的极性和挥发性存在较大差异。考察了中等极性的DB-624 柱和强极性的DB-Waxetr柱对21种酰胺类化合物的分离效果。

如图1所示，采用60 m长、1.4 μm厚液膜的DB-624 柱，即使放慢升温速率并延长高温持续时间，2种酰胺类化合物（N-癸酰基吡咯烷、N-肉豆蔻酰基吡咯烷）也未出峰，5 种酰胺（乙酰胺、甲酰胺、4-甲基-3-乙基-3-吡咯啉-2-酮、糠酰胺、1H-吡咯-2-甲酰胺）的色谱峰拖尾、响应强度低。采用30 m 长、0.25 μm 厚度液膜的DB-Waxetr 柱，分析时间短，21种酰胺类化合物均出峰，色谱峰形对称、响应强度高。因此，选用DB-Waxetr 柱对酰胺类目标物进行色谱分离。

图1 21种酰胺类化合物在DB-624柱（a）和DB-Waxetr柱（b）上分离的色谱峰Fig.1 Chromatographic peaks of 21 amides separated on DB-624（a）and DB-Waxetr columns（b）

2.2.2 选择反应监测条件确定

多反应监测（MRM）定量定性离子对是串接质谱的核心参数，直接影响分析方法的灵敏度和选择性。进行了离子对优化试验：全扫描模式下，获取酰胺目标物的一级质谱图，选取较大质荷比、较高丰度的碎片离子作为母离子；产物离子扫描模式下，获取母离子在不同碰撞电压下的二级质谱图，选取较大质荷比、较高丰度的子离子以及与其对应的母离子和碰撞能（CE）作为MRM离子对。采用基质加标实验验证所选离子对抗基质干扰的能力，最终确定了21 种酰胺类化合物及内标的定量定性离子对和碰撞能，如表3所示。

表3 酰胺类目标物的MRM参数Tab.3 MRM parameters of 21 amide compounds

2.3 烟气中酰胺的气粒相分布

采用剑桥滤片捕集卷烟烟气粒相物。所选卷烟样品中可检出16 种酰胺类化合物，分别为N-甲酰基吡咯烷、乙酰胺、甲酰胺、异丁酰胺、丙酰胺、N-乙酰基吡咯烷、异戊酰胺、N-异戊酰基吡咯烷、N-丁酰基吡咯烷、丙烯酰胺、4-甲基-3-乙基-3-吡咯啉-2-酮、糠酰胺、N-乙基烟酰胺、N-甲基烟酰胺、1H-吡咯-2-甲酰胺和烟酰胺；N-异丁酰基吡咯烷、N-丙酰基吡咯烷、巴豆酰基吡咯烷、N-癸酰基吡咯烷和N-肉豆蔻酰基吡咯烷5种酰胺类化合物未检出。

采用吸附管方式捕集气相成分，即在盛有剑桥滤片的夹持器后面串联吸附管，见图2。吸附管的吸附剂材料为XAD-4非离子型大孔树脂，吸附剂质量为120 mg。所选卷烟样品烟气气相成分中仅可检出乙酰胺，烟气气相成分中乙酰胺的量约为粒相物中的0.5%。

图2 卷烟主流烟气中酰胺捕集示意图Fig.2 Schematic diagram of the setup for trapping amide compounds from mainstream cigarette smoke

21 种酰胺类化合物的沸点均较高，除丙烯酰胺（沸点192.6 ℃）外，其余20 种酰胺类化合物的沸点均高于200 ℃。卷烟烟气中酰胺类化合物主要分布于粒相物中，因此，本研究中主要针对卷烟烟气粒相物中的酰胺开展研究。

2.4 提取条件优化

采用实验室自制卷烟进行前处理条件优化试验，21 种目标物中有16 种可检出。对于5 种未检出成分，采用基质加标方式，即在捕集卷烟烟气后的剑桥滤片上加入2 μg 目标物。将不同实验条件下各目标物的响应面积进行归一化处理，每个实验条件平行测定两次，结果取平均值。

2.4.1 提取溶剂及体积

对比了甲醇、乙腈、丙酮和二氯甲烷4 种溶剂对酰胺提取率的影响，结果见图3。甲醇极性强，对21种酰胺类化合物的提取效果最好，随着提取溶剂极性的减弱，部分酰胺类化合物（N-甲酰基吡咯烷、甲酰胺、1H-吡咯-2-甲酰胺）的提取率下降。结果表明，在甲醇中加入三乙胺后，有助于酰胺类化合物的提取。进一步考察了提取溶剂体积对提取结果的影响。8 mL溶剂可将剑桥滤片完全浸没，继续增加溶剂体积，提取率无明显变化。因此，选用8 mL 三乙胺-甲醇溶液进行提取。

图3 不同溶剂（a）、三乙胺（b）和溶剂体积（c）对21种酰胺类化合物提取率的影响Fig.3 Effects of different solvents（a），triethylamine（b）and solvent volume（c）on extraction efficiencies of 21 amide compounds

2.4.2 提取方式及时间

涡旋、超声和振荡为目前常用的样品提取方式。对比了涡旋（转速2 000 r/min）、振荡（转速180 r/min）、超声（功率280 W）各提取5、10、15、20 min对酰胺提取率的影响。研究中发现，超声后的提取溶液不稳定，放置后有絮状沉淀；涡旋和振荡提取溶液澄清透明。涡旋提取速率较快，5 min 即可将21 种酰胺提取完全（图4）。振荡提取时，随着提取时间延长，提取率逐渐增加，当提取时间为15 min时，各酰胺目标物提取完全。因此，选择涡旋方式提取5 min。

图4 涡旋时间（a）和振荡时间（b）对21种酰胺类化合物提取率的影响Fig.4 Effects of swirling time（a）and oscillation time（b）on extraction efficiencies of 21 amide compounds

2.5 基质净化吸附剂

由于烟气基质中存在大量杂质，提取液不经净化直接进样分析，会造成仪器污染，导致灵敏度降低。因此，有必要对提取液进行净化。分散固相萃取的关键是选择何种材料作为吸附剂。考察了N-丙基乙二胺（N-Propylethylenediamine，PSA）吸附剂、C18吸附剂和GCB 3 种材料对卷烟烟气基质净化效果和酰胺回收率（表4）的影响。

表4 3种吸附剂材料对21种酰胺类化合物回收率的影响Tab.4 Effects of three adsorbent materials on recoveries of 21 amide compounds

GCB 吸附剂净化后的样品溶液颜色最浅，对烟气基质的净化效果最好；PSA 吸附剂次之；C18吸附剂净化效果较差。采用3 种吸附剂净化基质时，21种酰胺的回收率范围分别为97%~100%（GCB）、77%~98%（PSA）、83%~100%（C18）。分析认为，C18吸附剂是在高纯硅胶基质上键合十八烷基，非极性烷烃对杂质以及酰胺目标物的吸附性能均较低；PSA 吸附剂是在高纯硅胶基质上键合N-丙基乙二胺，极性氨基的存在导致对杂质以及酰胺目标物均有较高的吸附性能；GCB 吸附剂是炭黑在惰性气体保护下加热到2 700 ℃左右生成的一种表面为光滑、无孔石墨晶型结构的碳材料，对烟气基质的吸附性能高，对酰胺目标物的吸附性能低。因此，选择GCB作为分散固相萃取吸附剂。

2.6 方法表征

配制21 种酰胺目标物的系列标准工作溶液，并建立标准工作曲线。分别以3倍和10倍信噪比响应浓度为检出限和定量限。采用自制卷烟样品，分别在低、中、高（50、200、1 000 ng/支）3个水平测定加标回收率（n=3）。对同一加标样品进行5 次日内和日间平行测定。如表5 所示，21 种酰胺类化合物标准工作曲线的相关系数均大于0.999，检出限和定量限范围分别为0.1~4.7和0.5~15.7 ng/支，平均加标回收率在90.7%~109.4%之间，日内和日间RSD范围分别为0.7%~6.9%和2.1%~8.1%。该方法线性关系良好，灵敏度和准确度高，精密度好，适用于测定卷烟主流烟气中的酰胺类化合物。

表5 21种酰胺类化合物分析方法的表征结果Tab.5 Characterization results of 21 amide compounds

2.7 实际样品测定

2.7.1 样品测定结果

采用所建立的方法对12 个不同品牌和不同焦油的市售卷烟样品进行测试，结果见表6。12 个市售卷烟样品中均可检出16 种酰胺类化合物，其余5种未检出，与自制卷烟检出情况一致。所检出的16种酰胺类化合物中，14种为感官相关成分，2种为有害成分；感官相关成分中，14 种酰胺类化合物为味觉成分，2 种为嗅觉成分，5 种为化学感觉成分。以平均单位TPM 释放量计，12 个卷烟样品中14 种感官相关酰胺类化合物（味觉成分）的释放量范围为0.4~309.0 ng/mg，2种有害酰胺成分的释放量范围为29.2~139.7 ng/mg；2 种嗅觉成分的释放量范围为20.9~25.2 ng/mg，5种化学感觉成分的释放量范围为2.4~299.2 ng/mg。

表6 卷烟样品主流烟气酰胺释放量（以单位TPM释放量计）Tab.6 Releases of amides in mainstream smoke of cigarette samples（normalized to per mass unit TPM） （ng·mg-1）

2.7.2 释放量影响因素分析

对12 个卷烟样品的酰胺类化合物释放量与TPM 求相关系数（表7），有12 种酰胺相关系数大于0.8，表明酰胺释放量与TPM 高度正相关。酰胺释放量除与TPM相关外，还受其他因素影响。

表7 卷烟烟气中酰胺释放量影响因素分析Tab.7 Analysis results of factors influencing amide compound releases in mainstream cigarette smoke

按照卷烟类型分类，对单位TPM 酰胺类化合物释放量进行T检验，有5 种酰胺（烟酰胺、N-甲基烟酰胺、N-乙基烟酰胺、1H-吡咯-2-甲酰胺、异戊酰胺）对应的P值小于0.01，表明混合型与烤烟型卷烟有极显著性差异；有2种酰胺（异丁酰胺、丙烯酰胺）的P值在0.01~0.05 之间，表明混合型与烤烟型卷烟有显著性差异。就该7种酰胺类化合物而言，混合型卷烟的单位TPM释放量明显高于烤烟型卷烟（图5）。

图5 单位TPM酰胺释放量与卷烟类型的相关性Fig.5 Correlation between releases（normalized to per mass unit TPM）of amides and cigarette types

3 结论

①采用分散固相萃取净化技术结合气相色谱-串联质谱建立了同时检测卷烟主流烟气中21 种酰胺类化合物的分析方法，该方法灵敏度高、准确性好、抗基质干扰能力强，适用于卷烟主流烟气中酰胺化合物的测定。② 卷烟主流烟气中酰胺类化合物主要分布于粒相物中。21 种酰胺类化合物中，卷烟样品可检出其中16 种，有5 种未检出。 ③12 种酰胺的释放量与TPM 呈高度正相关，7 种酰胺在混合型卷烟中单位TPM释放量明显高于烤烟型卷烟。