蛋鸭坦布苏病毒和鸭疫里默氏菌混合感染的诊断

张光洁，全秀振，李小敏，谭 军

1.湖南省衡阳市畜牧水产事务中心，湖南衡阳 421001；2.湖北省黄石市佳兴生物科技有限公司，湖北黄石 435100；3.湖南省衡阳市病害猪无害化处理中心，湖南衡阳421001

蛋鸭是我国的主要养殖产业之一，为满足人民群众的生活需求，养鸭规模加大，鸭病的发生率也显著升高[1]。在众多鸭病中，鸭坦布苏病毒（DTMUV）和鸭疫里默氏杆菌（RA）这2 种病原体引起的疾病对蛋鸭和肉鸭经济造成了严重危害[2]，其中DTMUV会使产蛋量急剧下降，最严重的可导致绝产，RA 是目前养鸭业中最严重的致病菌之一，发病率高，疫苗交叉保护有限，二者影响了养鸭行业的健康发展[3]。在临床实际情况中，鸭病的发生少见单个病原体感染，常为混合感染或继发感染，为鸭病的诊断和防治带来了很大的困难[4]。本研究运用病理剖检、细菌分离鉴定、病毒PCR 检测等方法，对湖南省某鸭场患病鸭进行疾病诊断，为这2 种病原体混合感染的诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要设备及试剂

无支原体胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；0.25%胰酶溶液（吉诺生物医药技术有限公司）；Taq DNA 聚合酶、Eastap Buffer、1dNTP（北京全式金生物技术有限公司）；Omega 胶回收试剂盒（北京Solarbio 科技有限公司）；琼脂糖凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit(200)，OMEGA 公司，货号D2500-02）；反转录试剂盒（TaKaRa 公司，货号RR047A）；TRIzol试剂（Invitrogen 公司，货号15596-026）；Tris-Hcl、Maleic acid Mo375（Sigma 公司）；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ（Roche公司，货号14761221）；全自动脱水机、自动染色封片一体机（德国莱卡公司），Nikon80i 生物光学显微镜为上海横桥仪器有限公司产品。

1.2 病料的来源及处理

本研究中病鸭来源于湖南某鸭场发病的80 日龄蛋鸭，首先对病鸭的发病情况和临床症状进行了解，随后对送检发病蛋鸭进行剖检，观察并记录各组织器官的病理变化。取病鸭脑组织做细菌的分离培养；取脑和卵巢组织用于病毒检测鉴定；取病鸭的脑、脊髓、坐骨神经、肝脏、心脏、卵巢等器官组织置于10%中性福尔马林溶液固定。

1.3 细菌的分离鉴定

1）细菌分离纯化。无菌挑取病鸭的脑组织，参照文献[4]的方法进行细菌的分离纯化。

2）细菌16S rRNA。参照文献[5]设计上游引物F：5’-GAGTTT-GATCMTGGCTCAG-3’，下游引物R：5’-TACCTTGTTA-CGACTT-3’。参照文献[5]进行细菌DNA 提取、PCR 扩增，测序，结果与Gen－Bank 上的序列进行BLAST 比对分析，引物合成及测序均送生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

1.4 病毒的分离鉴定

参照文献[6]设计上游引物F：5’-AGACTGCTG GTGCAATGAGAC-3’，下游引物R：5’-CGGTACCAT AATCCTCCATCTCAGC-3’，送至生工武汉技术部合成，其扩增的预期片段大小为300 bp。参照文献[6]进行病毒特异性序列的扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统拍照分析。

1.5 病鸭的组织病理学观察

采取的固定组织常规石蜡包埋、切片、常规HE染色。通过NIS-Elements 高清晰度彩色图文分析系统配合Nikon80i 生物光学显微镜对组织病理变化进行观察记录。

2 结果与分析

2.1 发病情况、临床症状及剖检变化

某鸭场自然发病的80 日龄蛋鸭，临床症状主要表现精神萎靡不振，头颈震颤，瘫痪，无法行走（图1A）。剖检可见肝、心表面有白色膜状渗出物，其他各脏器未发生明显异常（图1B）。

图1 病鸭的临床症状和剖检变化

2.2 细菌的分离鉴定结果

脑病料无菌接种5%血清的TSA 培养皿，经培养约36 h 后，在平板上有细小的圆形、凸起菌落生长，呈透明露珠样，革兰氏染色显示为阴性短杆菌。

提取分离细菌的DNA，进行PCR 扩增，其扩增产物的电泳结果可见片段大小为1 500 bp 左右，与预期结果相符。将PCR 产物送去测序，将测序结果在NCBI BLAST 上分析比对，发现序列与鸭疫里默氏杆菌的相似度在98%以上。根据国际分类标准，可确定细菌为鸭疫里默氏杆菌。

2.3 鸭坦布苏病毒的检测与鉴定

从本试验的电泳结果中可以看出，扩增产物的条带处于300 bp 的位置，与预期扩增片段的大小一致。将PCR 产物送去测序，将序列在NCBI BLAST 上分析比对，发现序列与鸭坦布苏病毒相似性在99%以上。根据国际分类标准，可确定病毒为鸭坦布苏病毒。

2.4 病理组织学检查结果

病鸭的主要病变是脑血管周围间隙增大，水肿，淤血，脑组织出现卫星现象和噬神经元现象（图2A）；脊髓有局灶性出血和卫星现象（图2B）；坐骨神经水肿，神经纤维坏死、钙化（图2C）；卵巢血管周围出现巨噬细胞、异嗜性粒细胞等炎性细胞浸润（图2D）；卵泡未见明显异常；心外膜、肝被膜增厚，表面附有大量纤维素性渗出物，其中有大量异嗜性粒细胞和淋巴细胞浸润（图2E、图2F）。

3 讨论

本研究通过细菌的分离鉴定和病毒的PCR 检测，该群病鸭为鸭坦布苏病毒和鸭疫里默氏杆菌的混合感染。鸭疫里默氏杆菌主要危害1～8 周龄尤其是1～3 周龄的雏鸭，最主要的临床病理特征是广泛的纤维素性浆膜炎[5]。鸭坦布苏病毒病感染蛋鸭的主要症状表现为采食量下降，产蛋下降和神经症状[7-8]。其中，雏鸭感染DTMUV 主要症状表现为采食量下降，共济失调。鸭对鸭坦布苏病毒的易感性与日龄呈相关性，且日龄越小越易感[9]。本研究中发病鸭为80 日龄蛋鸭，未到产蛋年龄，主要临床症状为精神萎靡，出现划水样动作，无法走路。病理组织检查结果大脑、脊髓和坐骨神经均有明显病理损伤，卵巢有炎症，肝、心浆膜有明显的纤维素性炎，符合鸭坦布苏病毒和鸭疫里默氏杆菌混合感染的病理特征。

雏鸭感染坦布苏病毒，主要表现为神经系统损伤，感染该病毒后还会使病鸭免疫力下降，有免疫抑制作用[10-11]。因此，感染鸭坦布苏病毒后，病鸭容易继发感染其他病原体。分析推测本研究中病鸭感染鸭坦布苏病毒病后免疫力下降，继发鸭疫里默氏杆菌感染导致混合感染。在日常饲养中，应加强鸭场的生物安全措施落实，做好疾病防控。在感染坦布苏病毒时，应及时隔离治疗，避免继发感染其他病原体。