骆驼源性标准物质研制工艺优化及性能评价

2023-08-01汪星宇邢圆莹徐香富伍志强李娟郭俊利马荥施蕊何霞红季超郑文杰

科技资讯 2023年12期

汪星宇邢圆莹徐香富伍志强李娟郭俊利马荥施蕊何霞红季超郑文杰

摘要：為了得出骆驼源性标准物质研制工艺的最佳组合，通过对经真实性鉴定的骆驼肉的切肉形状（片状、条状和块状）、蒸制时间（0、20、30、40 min）与干燥工艺（冷冻干燥、40、50、60 ℃）3个关键标准物质研制工艺参数进行优化，以成粉率为考核指标，并以《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》（GB/T 38164-2019）中骆驼源性成分实时荧光多聚核苷酸链式反应（Real-time Polymerase Chain Reaction，PCR）鉴定方法进行脱氧核糖核酸（Deoxyribo Nucleic Acid，DNA）测试，检验标准物质的稳定性与均匀性，确定了条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm），隔水蒸制30 min后在50 ℃下烘干后成粉率最高，达到了93.72%，且研制的骆驼源性标准物质均一性和稳定性均经F检验，无显著差异。该研究所建立的骆驼源性标准物质研制工艺，成粉率高且均一，为高脂肪类样品成粉的研究提供借鉴，为动物源性标准物质提供了研制工艺和技术参数，且研制的骆驼源性成分定性标准样品达到国家标准样品的技术要求，可用于对食品中骆驼源性成分检测过程的方法验证与质量控制等活动。

关键词：标准物质骆驼肉研制工艺响应面性能评价

中图分类号：TS254.4 文献标识码：AOptimization and Performance Evaluation of the Development Process of Camel-Derived Reference MaterialsWANG Xingyu1 XING Yuanying1 XU Xiangfu1 WU Zhiqiang1 LI Juan1 GUO Junli1 MA Ying1 SHI Rui2 HE Xiahong2 JI Chao1 ZHENG Wenjie1*

Key Words： Reference materials; Camel meat; Development process; Response surface; Performance evaluation

駱驼在动物学分类中归属于哺乳纲（Mammalia）、偶蹄目（Artiodactyla）、驼科（Camelidae）、驼属（Camelus），其骆驼肉具有高水分、高蛋白、低脂肪及低胆固醇等特点[1-3]，具有一定的药用和保健价值，对呼吸系统疾病、胃酸过多、高血压及肺炎等疾病均有疗效[4]。而目前针对骆驼源性成分检测的标准包括2项国家标准、2项行业标准和1项地方标准，即《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》（GB/T 38164-2019）、《动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法 PCR方法》（GB/T 21100-2007）、《出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第4部分：骆驼成分检测 PCR-试纸条法》（SN/T 5145.4-2019）、《出口食品中骆驼源性成分的检测实时荧光PCR法》（SN/T 4418-2016）和《骆驼源性成分检测方法实时荧光PCR法》（DB15/T 2026-2020），但尚未有相对应的标准物质来质控检测过程。

而在食品安全检测体系中，标准物质对整个检测质量控制体系起到核心作用，在实物标准样品研制过程中对于样品均一性也有着严格要求[5]，所以成粉工艺对于实物标准物质的研制也是不可或缺的。同时，“十四五”规划中明确提出健全国家标准样品管理机制，完善协调配套的国家标准样品体系[6]，现有的标准样品涉及金属[7]、农残[8]、微生物[9]等领域的研制，缺乏动物源性成分的实物标准样品的研制。目前，针对肉类加工工艺的研究有中华鲟[10]、鸡肉[11]、鹅[12]等物种，加工工艺的因素有蒸煮时间、烘烤温度[13-14]等条件，干燥工艺方法的研究有微波干燥、红外干燥、烘箱、烤箱等[15-17]，但这些研究未对肉粉加工工艺有系统性的最优条件比较，且未有研究对骆驼源性标准物质的成粉工艺进行探讨。

因此，该研究针对上述问题，在已有研究的基础上[18]，首先通过动物源性鉴定通用引物对骆驼鲜肉进行分子鉴定，然后针对切肉形状、蒸制时间与烘干温度3个关键标准样品研制工艺参数进行单因素和响应面优化，并以成粉率和脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）扩增效率为考核指标，进一步评价研制骆驼源性标准物质的均一性和稳定性，以期为骆驼源性成分实物标准物质的均一性研制提供实验基础，来填补动物源性标准物质研制领域的空白。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

该研究所用的骆驼肉实验材料购自电商平台，参考标准《动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法》（GB/T 35918-2018）通过了骆驼肉真实性检验。

0.5 mol/L 乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）、1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris hydrochloride，Tris-HCI）、20%十六烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）；氯化钠、磷酸氢二钠（分析纯）；磷酸二氢钠、无水乙酸钠、异丙醇（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；蛋白酶K（20 mg/mL）、RNA酶（10 mg/mL）、DL1000 DNA Marker、6×Loading Buffer、TB Green Premix Ex Tag Ⅱ（Tli RNaseH Plus）；TE缓冲液（Tris-EDTA buffer solution，TE buffer）；Ultra GelRed（10，000×）；50×TAE缓冲液；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 仪器与设备

单罐行星式球磨机（Pulverisette 6型）；荧光定量聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测系统（NOVO Max100）；高速冷冻离心机（3K15型）；粉碎机（FSJ-A03E1）；SOP电子分析天平（精度0.001 g）；干燥箱（DHG-9031A）；梯度PCR仪（T100）；体式荧光显微镜（SMZ25）。

1.3 实验方法

1.3.1 研制工艺单因素优化

针对骆驼肉样的物理形态、蒸制时间、干燥工艺分别设计了3个梯度分组实验。将物理形态分为片状（2 cm×2 cm×0.5 cm）、条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm）、块状（1 cm×1 cm×1 cm）；蒸制时间设定为0、20、30和40 min；干燥工艺分为冷冻干燥，及烘干温度40、50、60 ℃，样品达到恒重后经球磨仪3 000 r/min，5 min的研磨，后过80目筛（粒径小于0.1 mm），通过成粉率进行研制工艺优化。每个处理重复10次。

1.3.2 研制条件优化响应面分析

运用Design-Expert软件，针对物理形态（片状（2 cm×2 cm×0.5 cm）、条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm）、块状（1 cm×1 cm×1 cm）、蒸制時间（20、30和40 min）、烘干温度（40、50和60℃）这3个因素，进行响应面实验设计，确定最佳工艺参数组合，并参照《肉松质量通则》（GB/T 23968-2022）进行感官评价筛选（表1）。

1.3.3 骆驼源性标准物质均一性检验

标准物质均匀一性是对标准样物的特性量值在空间分布的均匀程度的评价，是标准样品的重要质量指标之一[19]。参照《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》（GB/T15000.3-2008）规定，从同一批次制备的骆驼源性标准物质中随机抽取9瓶，依据《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》（GB/T 38164-2019）中建立的骆驼源性成分实时荧光PCR鉴定方法进行均一性检验。

1.3.4 骆驼源性标准物质稳定性检验

在适宜的储存条件下，标准物质的特性值在较长的一段时间内没有发生显著变化，即标准物质的稳定性良好[20]。参照《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》GB/T15000.3-2008规定，对标准物质进行两年的稳定性跟踪测定，将标准物质贮存在0～4℃低温条件下保存，分别在第一年的每2个月、第二年的每3个月随机抽取2瓶样品，采用《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》（GB/T 38164-2019）中的方法进行检测，依据实时荧光PCR扩增结果和Ct值分析骆驼源性标准物质稳定性。

1.4 数据处理

实验数据记录在Office 2016中，并以平均值±标准偏差表示，同时进行Duncan方差分析（P=0.05），以小写字母表示因素之间的显著性。响应面数据和统计分析在Design-Expert 10软件进行。

2 结果与分析

2.1 研制工艺单因素优化

由图1（a）可知，蒸制时间为30 min时过筛量更高，成粉率为（84.41±3.74）%；以条状肉蒸制30 min后进行干燥工艺（冻干、40、50、60℃）的优化，结果如图1（b0所示，鼓风干燥的温度为50 ℃时成粉率为（82.63±2.71）%，更有助于骆驼肉成粉。研究表明，过高的温度和较长的处理时间会降低肉粉中氨基酸的消化率[21]，将真实性鉴定合格的骆驼鲜肉分割为片状（2 cm×2 cm×0.5 cm）、条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm）、块状（1 cm×1 cm×1 cm）不同的物理形态，以30 min的蒸制条件和50 ℃的烘制条件进行处理，烘干完全后研磨过80目筛后，计算成粉率，由图1（c）可知，将肉切成条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm）成粉率为（80.89±3.64）%，结果显著高于片状（2 cm×2 cm×0.5 cm）和块状（1 cm×1 cm×1 cm）；综上，单因素优化结果中，最佳物理状态为条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm），最佳蒸制时间为30 min，最佳干燥工艺是鼓风干燥50 ℃。

2.2 骆驼肉粉工艺响应面优化

通过单因素试验确定的最佳实验条件进行响应面实验，条件如下：物理状态（A）（片状（2 cm×2 cm×0.5 cm）、条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm）、块状（1 cm×1 cm×1 cm））、蒸制时间（B）（20、30和40 min）、烘干温度（C）（40、50和60℃），进行三因素三水平设计，如表2所示，并根据设计组进行实验，表3为不同响应面条件下得到的过筛率，表4表明模型整体极显著（P<0.01），失拟项不显著，R2=0.061 7，模型整体拟合较好，其中一次项：物理形状和干燥温度影响显著，蒸制时间影响极显著；交互项之间影响不显著。根据模型拟合结果，预测理想条件下的最佳条件为条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm），蒸制时间32.019 1 min，烘干温度为46.465 9 ℃，根据响应面试验预测结果结合实际条件确定最佳标准物质研制成粉工艺参数为：骆驼肉切成条状（4 cm×0.5 cm×0.5 cm），蒸制30 min后以50 ℃烘干，研磨过筛，经体式显微镜观察骆驼成粉的粉末均匀（见图2）；但也观察粉末之间由于静电吸附存在结团现象，针对此现象，后续有待进一步研究如何消除粉末之间的静电作用。

2.3 感官评价

从颗粒形态与大小、色泽、气味和是否存在杂质等5个方面对不同研制工艺形成骆驼肉粉进行显微观察（见图3）和感官评定，满分以100分计。在室温（25 ℃）下由10人成立的固定评定小组，参照表1进行感官评定。结果如表7所示，第5组响应面条件的感官评价结果最佳的，与响应面结果是一致的。

图3 骆驼肉粉响应面结果显微图

表5 感官评定结果

序号

颗粒形态

颗粒大小

色泽

气味

杂质

综合评分

2.4 駱驼源性标准物质均匀性检验

参照标准GB/T 38164-2019中的方法进行实时荧光PCR检测，并根据扩增曲线和Ct值判定结果。在阳性对照和阴性对照均正常的情况下，Ct值≥40，可判断该基因扩增结果为阴性；Ct值＜35，可判断该基因扩增结果为阳性，如表6所示，结果表明，经F检验，计算F统计量为0.128 7，小于F（8，18）=2.510 1，且P值不显著，说明研制的骆驼源性标准物质是均匀的。

2.5 骆驼源性标准物质储存稳定性检验

在适宜的保藏条件下，标准样品物质的稳定性应不会随着贮存时间、运输时间的延长发生显著变化。参照《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》（GB/T15000.3-2008）规定，对标准样品物质进行两年的稳定性跟踪测定，将标准样品物质贮存在0～4 ℃低温条件下保存，分别在第一年的每2个月、第二年的每3个月随机抽取23瓶样品，采用《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》（GB/T 38164-2019）中的方法进行检测，依据实时荧光PCR扩增结果和Ct值分析骆驼源性标准样品物质储存稳定性。如表7所示，结果表明，经F检验，计算F统计量为1.156 1，小于F（9，20）=2.392 8，且P值不显著，表明研制的骆驼源性标准物质储存在0～4 ℃低温条件下是稳定的。

3 结论

该研究为实现将骆驼肉研制成均匀分散的骆驼粉，对骆驼源性标准物质研制的工艺进行研究，通过优化制粉的物理状态、蒸制时间及烘干温度，并以成粉的粒径为考核指标，探讨均匀分散的骆驼源性标准物质成粉工艺，同时也验证了研制的骆驼源性标准物质的均一性和稳定性，表明该研究所研制的骆驼源性标准物质可用于相关标准的实物参考，该研究结果为高脂肪类样品成粉的研究提供借鉴，为动物源性标准物质提供了研制工艺和技术参数，填补了动物源性标准物质研制领域的空白。

参考文献[1] LAMYAA M A.Discrimination of Pork Content in Mixtures with Raw Minced Camel and Buffalo Meat Using FTIR Spectroscopic Technique[J].American Astronomical Society，2013，42（3）：224.

[2] 李昱奇.特味骆驼肉片休闲食品的开发[D].呼和浩特：内蒙古农大学，2021.