响应面法优化产纤维素酶菌株深层液体发酵的条件

藏金萍++韩志校++姜军坡

摘要：为提高解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Tu-115菌株产纤维素酶的能力，以滤纸酶活力为指标，根据Box-Benhnken中心组合试验的设计原理，设计4因素3水平试验，建立以滤纸酶活力为响应值的二次回归方程模型，并利用响应面法分析得到深层液体发酵的最优条件是：葡萄糖含量为4.4%，豆饼粉含量为0.7%，接种量为 3.0%，装瓶量为67.6 mL，此时供试菌株相应的滤纸酶活力达到12.32 U/mL，菌株产纤维素酶活力提高了27.4倍。

关键词：响应面；滤纸酶；纤维素酶；发酵条件；菌株

中图分类号： TQ920.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0368-03

收稿日期：2015-02-16

基金项目：国家星火计划（编号：2010GA105010）；石家庄市科学技术研究与发展计划（编号：08150142A）。

作者简介：藏金萍（1981—），男，辽宁抚顺人，硕士，实验师，主要从事分子与微生物学研究。E-mail：jpzang@163.com。

通信作者：姜军坡，硕士，讲师，主要从事农业微生物方向研究。Tel：（0312）7528273；E-mail：jjp_poe@126.com。纤维素是丰富的可再生资源和碳水化合物，可转化为糖类，并进一步转化成乙醇、菌体蛋白或气体燃料。农作物秸秆的主要成份是纤维素，而我国目前农作物秸秆的年产量可达10 t，其中一半以上被焚烧或废弃[1]。人口增加和耕地面积锐减之间的矛盾，使人畜争粮问题日益突显。通过纤维素酶降解、利用纤维素资源已成为目前非常规资源研究的热点[2]，提高纤维素的转化效率，对解决当今世界面临的环境污染、饲料资源紧张和能源危机等具有重大的现实意义[3]。

纤维素酶是微生物分解纤维素时合成的一种胞外酶，其产量直接影响纤维素的利用率。在发酵过程中，通过一定的外部条件优化，可以提高产酶活力[4]。纤维素酶发酵条件优化常采用单因素和正交试验设计相结合的方法，但这种方法不能考察各因素之间的交互作用，无法实现各因素达到最优[5]。响应面分析法通过合理的试验设计，可使用最少的试验次数尽可能精确地估计各因素，对各因素水平及其交互作用进行评价和优化，快速有效地确定多因子的最佳条件[6-8]，是一个十分有效的优化试验方法。

解淀粉芽孢杆菌Tu-115菌株是一株胞外产纤维素酶，能有效抑制大肠杆菌，本研究组对其产纤维素酶的发酵条件已进行一些研究[9-10]，但菌株固体发酵生产机械化程度较低，缺乏在线传感仪器，过程控制较为困难，不利于大规模生产。本试验在前期单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken组合设计，考察影响Tu-115菌株深层液体发酵产纤维素酶的关键因素如葡萄糖含量、豆饼粉含量、接种量、装瓶量，旨在利用响应面法确定该菌株液态发酵产纤维素酶的最佳工艺参数，为其大规模液态发酵和应用奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌株Tu-115菌株，由河北农业大学生命科学院制药工程系提供。

1.1.2培养基及试剂Mandels无机盐营养液、DNS试剂，配制方法参考文献[9]；芽孢杆菌种子培养基和基础发酵培养基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Mandel′s无机盐营养液100 mL，自然pH值。

1.2试验方法

1.2.1Tu-115菌株产纤维素酶活性的测定

1.2.1.1酶活力测定原理采用3，5-二硝基水杨酸比色法[11]（DNS法）测定纤维素酶的酶活力。

1.2.1.2标准曲线的绘制精确称取无水葡萄糖分析纯100 mg，溶于蒸馏水中，定容至100 mL，即得浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准母液；取11支试管，分别加入不同体积的葡萄糖标准母液，用蒸馏水定容至50 mL，将母液稀释成不同浓度；分别吸取1.0 mL，分别加入3 mL DNS，沸水浴10 min；用流水冷却至室温，加入6.0 mL蒸馏水，混匀，测定吸光度，以葡萄糖浓度为x轴，吸光度为y轴绘制标准曲线。

1.2.1.3Tu-115发酵液纤维素酶比活力测定取发酵液 1 mL 加入EP管中，12 000 r/min离心5 min；试管中加入 0.5 mL 上清液，加入1 mL浓度为1 mol/L NaOH溶液，摇匀以终止反应；加入75 mg滤纸和1.5 mL浓度为0.05 mol/L、pH值为4.5的乙酸钠溶液，50 ℃反应30 min；加入3 mL DNS试剂，沸水浴10 min，冷却，所得溶液作为空白调零。

在另1支试管中加入75 mg滤纸、1.5 mL浓度为 0.05 mol/L、pH值为4.5的乙酸钠溶液和0.5 mL粗酶液，50 ℃ 反应30 min，加入1 mL浓度为1 mol/L NaOH溶液，摇匀以终止反应；加入3 mL DNS试剂，沸水浴10 min，冷却，测定吸光度。每1 min催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.2.2Tu-115菌株种子液培养将菌种用5 mL无菌蒸馏水从1支斜面培养基上冲洗下来，接种于装有种子培养基的250 mL三角瓶中，装瓶量为100 mL；37 ℃ 200 r/min，摇床培养12 h，待用。

1.2.3响应面优化Tu-115菌株产纤维素酶条件采用Box-Benhnken组合设计，对影响菌株产纤维素酶的4个因素分别选取不同水平（表1），以进行响应面优化分析。

2结果与分析

2.1DNS法测定葡萄糖浓度的标准曲线

根据DNS法测定葡萄糖吸光度值，得回归方程为y=1.393 8 x（r2=0.996 6），其线性关系良好。绘制葡萄糖标准曲线见图1。

2.2响应面发酵试验与数据回归

采用Box-Benhnken组合设计，对影响菌株Tu-115产纤维素酶的4个关键因素进行29组试验，计算滤纸酶活力及其平均值（表2）。采用Design Expert 8.0.6软件，对响应面试验数据进行多元回归拟合，以滤纸酶活力为响应值（Y），葡萄糖含量、豆饼粉含量、接种量、装瓶量为自变量，建立回归方程为：Y=-47.096+15.537A+1.526B+1.529C+1.198D+0.258AB+0.297AC-5.208×10-3AD+0.364BC+1.347×10-2BD+0.0680CD-1.826A2-2.877B2-0.787C2-1.025×10-2D2（R2=0.740 2），方程拟合程度良好，试验误差较小。

2.3回归方程显著性检验

由表3可见，以滤纸酶为指标的产纤维素酶深层液体发表3以滤纸酶为指标的产纤维素酶深层液体发酵条件响应面模型和回归系数显著性检验

酵条件响应面模型P值为0.004 3，小于0.01，说明不同条件下差异具有极显著性，试验方法可行；失拟项不显著，这表明模型选择相对合适；A、B、A2、D2对滤纸酶活的影响显著，其他各因素交互作用均不显著，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系；由P值大小可知，各因素对结果的影响大小为：豆饼粉含量>葡萄糖含量>接种量>装瓶量。离散系数（CV）一般表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本试验CV值为0.004 3，在可接受范围内，所得二次回归方程可以很好地对响应值进行预测。

2.4响应面分析

利用Design Expert软件对数据进行二次多元回归，拟合得到二次回归方程的响应曲面及其等高线。由图2至图7可见，葡萄糖含量与豆饼粉含量相互作用较弱，沿豆饼粉含量方向的等高线密度大于沿葡萄糖含量方向的等高线密度，豆饼粉含量对酶活力的影响大于葡萄糖含量（图2）；葡萄糖的含量与接种量相互作用较强，沿葡萄糖含量方向的等高线密度大于沿接种量方向的等高线密度，葡萄糖含量对酶活力的影响大于接种量（图3）；葡萄糖的含量与装瓶量相互作用较强，沿葡萄糖含量方向的等高线密度大于沿装瓶量方向的等高线密度，葡萄糖含量对酶活力的影响大于装瓶量（图4）；接种量与豆饼粉的含量相互作用较强，沿豆饼粉含量方向的等高线密度大于沿接种量方向等高线的密度，豆饼粉含量对酶活力的影响大于接种量（图5）；豆饼粉含量与装瓶量相互作用较强，沿豆饼粉方向的等高线密度大于沿装瓶量方向的等高线密度，豆饼粉含量对酶活力的影响大于装瓶量（图6）；接种量与装瓶量的相互作用较强，沿装瓶量方向的等高线密度小于沿接种量方向的等高线密度，装瓶量对酶活力的影响小于接种量（图7）。

2.5Tu-115菌株产纤维素酶响应面结果的优化分析和条件验证

试验结果表明，回归方程对响应面法优化Tu-115菌株产纤维素酶深层液体发酵条件试验结果拟合良好，可用此回归方程对该菌株产纤维素酶深层液体发酵条件进行优化分析。采用Design Expert 8.0.6软件获取滤纸酶活力极大值，方法为：选取Optimization→Numerical→Criteria，选定指标“滤纸酶活力”；Goal设定为maximize→Solution，从Solution寻找最大响应值为12.23 U/mL，此时葡萄糖含量为4.44%、豆饼粉含量为0.67%、接种量为2.95%、装瓶量为67.61 mL。考虑试验的实际情况， 确定最优条件为葡萄糖含量为4.4%、豆饼粉含量为0.7%、接种量为3.0%、装瓶量为67.6 mL，此条件测定得该菌株相应的滤纸酶活力为（12.32±0.41）U/mL（n=6）。优化前采用基础发酵培养基培养该菌株对应的平均酶活力为（0.45±0.02）U/mL（n=6），优化后菌株产纤维素酶活力提高了27.4倍。

3结论

本试验采用DNS染色法，通过Box-Behnken试验设计及响应面分析，对以Tu-115菌株产纤维素酶的深层液体发酵条件进行优化，得到由影响产纤维素酶活力发酵的各因素变量构成的二次方程，该模型回归显著，对试验结果拟合良好。在此基础上，确定Tu-115菌株产纤维素酶的深层液体发酵最优工艺条件，为该菌株的大规模发酵和应用奠定了良好基础。采用响应面法能很好地预测产纤维素酶的深层液体发酵条件，方法简单易行，结果可靠，具有一定的实用和推广价值。

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