生物素导致电化学发光法检测高敏肌钙蛋白T 假阴性1 例

王晓燕 李玉杰 武双全 李佩佩

患者，男，44 岁，因“反复胸闷痛2h”于2023 年1 月23 日就诊于我院。患者无明显诱因反复出现心前区闷痛，持续不缓解。无咳嗽，无呼吸困难，无双下肢水肿，无端坐呼吸，无心悸，无视物旋转，无头痛，无乏力，无反酸、嗳气，无恶心呕吐，伴头晕，无双眼黑矇、晕厥等。为明确病因就诊于急诊，考虑急性心肌梗死，开通绿色通道行急诊造影。造影示：左主干无狭窄；前降支弥漫性斑块浸润，近段约50%狭窄，D1 中段约80%狭窄，血流TIMI3 级；回旋支弥漫性斑块浸润，中段约95%狭窄，血流TIMI3 级；右冠状动脉细小，中段约80%狭窄，血流TIMI3 级。既往有“高血压3 级、痛风、肾结石”病史，自服药物治疗，具体不详；否认肝炎、结核等传染病史，否认外伤史，否认输血史，否认食物、药物过敏史，否认家族传染病、代谢性、遗传性疾病及类似病史。体格检查：T 36.3℃，P 80次/min，R 18 次/min，BP 110/80mmHg。心律齐，心音有力，P2＜a2。各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音，未闻及心包摩擦音。实验室检查：高敏肌钙蛋白T（High-sensitivity troponin T，hs-cTnT）为0.008ng/mL（0～0.014 ng/mL），肌红蛋白（Myoglobin，Mb）为80.79ng/mL（28～72ng/mL），肌酸激酶MB 同工酶（Creatine kinase-MB，CKMB）为2.11ng/mL（0～5ng/mL），N 端脑钠肽前体（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，NTproBNP）为48.50pg/mL（0～450pg/mL）。心电图示：窦性心动过缓，异常Q 波（Ⅱ、Ⅲ、aVF），ST 段抬高（Ⅱ、Ⅲ、AVF、V5、V6），下壁心肌梗死。初步诊断：①冠心病，急性ST 段抬高型心肌梗死，心功能Ⅱ级（Killip）；②高血压3 级（很高危）；③痛风；④4 肾结石。患者于LCX 植入冠状动脉支架1 枚后安返病房。

次日，患者再次监测心肌损伤指标及NTproBNP：hs-cTnT 为0.011ng/mL，Mb 为152.26ng/mL，CK-MB 为293ng/mL，NT-proBNP 为776.11pg/mL。结果提示，除hs-cTnT 外，其余心肌损伤指标均大幅升高。其他异常指标包括：游离三碘甲状腺原氨酸（Free triiodothyronine，FT3）6.35pg/mL，游离甲状腺素（Free thyroxine，FT4）3.85ng/dL、三碘甲状腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）2.36μg/mL、甲状腺素（Thyroxine，T4）19.86μg/dL，促甲状腺激素促甲状腺素（Hyroid stimulating hormone，TSH）0.21uIU/mL，白细胞计数（WBC）27.62×109/L，中性粒细胞百分率82.8%，单核细胞百分率5.2%，中性粒细胞绝对数22.87×109/L，尿酸541.0μmol/L，天门冬氨基酸转移酶274.7U/L，α 羟基丁酸脱氢酶576.0U/L，小而密低密度脂蛋白胆固醇1.39mmol/L，载脂蛋白B1.35g/L，丙肝抗体阳性为20.600COI，尿隐血4+，而血红蛋白、血小板、红细胞沉降率、谷丙转氨酶、总胆红素、肌酐、尿素、空腹血糖、糖化血红蛋白、三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、电解质、D-二聚体、肿瘤标志物、凝血8 项、丙肝RNA 确诊实验，梅毒螺旋体抗体、人免疫缺陷病毒抗体、乙肝表面抗体、乙肝e 抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体、乙肝表面抗原、抗链球菌溶血素O、类风湿因子、抗核抗体、巨细胞病毒核酸、EB病毒核酸、血尿免疫固定电泳等均无明显异常。患者有明确的急性心肌梗死症状和体征，冠脉造影、心电图及心肌酶谱监测均提示心脏损伤，但hscTnT 浓度正常未升高。另外，患者的甲状腺功能检测提示Graves 病，但患者无相应临床表现。甲状腺彩超示：甲状腺大小形态可，实质回声均匀，彩色多普勒血流显像正常。

我院hs-cTnT 检测平台为Cobas e601 原装系统，配套试剂。检验方法学为电化学发光法，该方法是基于生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system，BAS）免疫捕获放大标记技术。在确认标本无溶血、脂血、高胆红素、高血红蛋白，hs-cTnT 质控正常的基础上，进行标本复测和连续稀释测定（见表1），排除了随机误差和高浓度Hook 效应。最终我们考虑药物或患者体内存在未知干扰因素，导致hs-cTnT 浓度的假性降低。通过与患者及家属的沟通，我们获知患者为改善发量稀疏和发际线后移的状态，10 天前在某平台购买“防脱发黑科技”产品并持续服用，通过链接详情查阅其有效成分为生物素，每粒含量高达1 000mcg（1mcg=1μg）。我们使用hs-cTnT 试剂盒中试剂-工作溶液M（包被链霉亲和素的磁珠微粒，1 瓶12.4mL；包被链霉亲和素的磁珠微粒0.72mg/mL；防腐剂）进行同批标本的中和处理后再测（见表1），检测结果大幅升高，确定了生物素造成了hs-cTnT 的假性降低。另外，甲状腺相关激素的检测系统，也是基于BAS 化学发光反应原理的罗氏平台（Cobas，Elecsys，Modular），因TSH用夹心法模式而结果假性减低，T3、T4、FT3、FT4采用竞争法模式而结果假性升高，同样使用中和处理后再测（见表2），检测结果基本恢复正常。

表1 hs-cTnT 标本复测、连续稀释测定和中和处理后再测结果

表2 甲状腺相关激素中和处理后再测结果

讨论肌钙蛋白T（Troponin T，cTnT）是参与横纹肌收缩的一种调节蛋白，是心肌损伤特异性和高敏感性的标志物。研究显示[1]，hs-cTnT 有助于将急性冠脉综合征（ACS）的观察时间从6h 缩短到3h，也从根本上改变了ACS 诊断、预后判断、治疗和危险分层的格局。近年欧洲心脏病协会（ESC）、美国心脏病协会（AHA）、国家临床检验师协会（NICE）陆续发布了hs-cTnT 的临床应用指南，并持续细化更新。然而在临床检验中，hs-cTnT 的检测受到测试平台、方法学、标本中内源性干扰物质的因素限制，出现检测结果假阳性的案例不断被报道[2]。目前，国外基于BAS 电化学发光技术检测hs-cTnT 的假阴性案例鲜见[3]，国内尚未查阅到相关文献。

BAS 电化学发光技术检测hs-cTnT 受到多种因素干扰（见表3），本例患者标本血清胆红素、血红蛋白、血脂、类风湿因子、白蛋白均在正常值范围，高浓度hook 效应通过稀释测定予以排除，同时未查阅到痛风和肾结石合并hs-cTnT 假阴性的报道，本中心推测，药物或内源性生物素干扰BAS 免疫捕获反应，结合中和实验结果，验证了内源性生物素导致hs-cTnT 检测的假性降低。

表3 BAS 电化学发光技术检测hs-cTnT 的局限性（Cobas）

生物素（Biotin）为B 族维生素之一，又称维生素H、维生素B7、辅酶R（Coenzyme R）等，是20 世纪30 年代在研究酵母生长因子和根瘤菌的生长与呼吸促进因子时，从肝中发现的一种可以防治由于喂食生鸡蛋蛋白诱导的皮肤损伤和大鼠脱毛的营养因子。目前，相较于美国人群，中国人群的适宜推荐量偏低[4，5]。近年来，生物素被广泛应用于生物素缺乏症、代谢性疾病、甲状腺功能亢进、多发性硬化症、维生素D 中毒等的临床治疗[6]和美甲、美发、预防少年白发、孕期营养保健等领域[7]。口服生物素迅速从胃和肠道吸收，血液中的生物素80%以游离形式存在。生物素对BAS 免疫捕获技术（双抗体夹心法图1）的干扰机制为内源性生物素和试剂盒中的生物素会竞争性结合链霉亲和素磁微粒（Streptavidin-coated microparticles，M）[8]，致使反应体系中生物素的总量超出了M 的结合能力，导致捕获的发光物质减少[9]，光信号减弱，从而引起检测结果的假性减低[10]；对BAS 免疫捕获技术（竞争法图2）的干扰机制是生物素抑制生物素-链霉亲和素标记抗体固定，从而使得检测结果假性升高[11]。

图1 双抗体夹心法反应原理

图2 竞争法反应原理

2017 年11 月，美国食品和药物管理局（FDA）公布一份由于生物素干扰而导致肌钙蛋白测定不准确引起患者死亡的报告，提醒临床医生及实验室工作者：大剂量补充生物素可能会导致实验室检测结果出现误差，从而引起临床误诊误治[12]；Li 等[13]的研究结果显示，当生物素浓度达到31.3ng/mL 时，肌钙蛋白水平会显著降低，降低比例接近20%。自此，生物素对于hs-cTnT 检测的干扰引起了多位学者的关注，目前已证实与多种因素相关，如检测平台[14]、检测项目[15]、反应模式[16]、反应体系中各组分占比[9]等，与待测物水平无关[8]。FDA 建议[12]：如果实验室检测结果与患者的临床表现不符，应考虑将生物素干扰作为可能的原因。Piketty 等[15]研究发现，Cobas 平台的所有项目均易受到样本来源的生物素干扰，而Centaur 平台中已经通过生物素试剂-链霉亲和素磁微粒的预制，所以抗生物素干扰能力最强。这提示我们，标本的M 中和处理，可有效减低生物素干扰作用，这与Piketty 等[16]和Yang等[17]研究相符。

本例患者有典型的急性冠脉综合征体征，冠脉造影和心电图检查均提示心肌受损，但hs-cTnT 的连续监测结果并未出现剂量-释放曲线的一般特征，在排除标本因素和其他实验因素外，应及早考虑生物素导致hs-cTnT 假性降低的可能，并通过M中和处理进行验证。在本研究中，患者合并痛风和肾结石，或者患者体内是否存在其他导致hs-cTnT假性降低的干扰因素，我们尚未可知。另外，临床对生物素如何干扰检测项目的了解仍然太少。生物素的服用剂量、服用时间及受影响的项目类型等，仍需要进一步系统的研究评估。

目前hs-cTnT 的检测技术，国际上以Cobas 平台为代表已经实现了检测的国际标准化，国内重庆中元汇吉等民族企业也在迅速崛起。Cobas 公司于2019 年开发出了生物素特异性磁性纳米载体，作为抗生物素干扰组分添加至反应体系中，通过特异性结合游离生物素，从而减少生物素干扰，但目前尚未进入市场。所以从检验的局限性入手，当hscTnT 检测结果与临床综合表现不相符时，要及时与临床沟通，警惕随机误差的可能，更要对造成检测项目假性升高或减低的干扰因素进行验证和探讨，如更换检测平台，更换方法学，进行标本的中和处理等，以保证检测结果的准确可靠。