基于国家专利数据库和网络药理学探讨中药复方治疗肝硬化腹水的配伍规律及作用机制*

徐 喆 周会芳 龚博炀 王 莹 赵泽宇 边育红

天津中医药大学中西医结合学院 (天津, 301617)

近年来,随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变,肝病及其相关并发症已成为全球重大公共卫生问题[1,2]。肝硬化是各种慢性肝病的终末期发展阶段之一,而腹水是肝硬化的常见并发症,预示着肝硬化进展为失代偿期,其临床预后不佳,3年内死亡率达50%[3]。门静脉高压症和钠水潴留是腹水形成的两个关键因素[4]。肝硬化腹水严重降低了患者的生活质量,给社会带来沉重的经济负担。限钠、利尿、大容量腹腔穿刺术和经颈静脉肝内门体支架分流术是西医治疗肝硬化腹水的主要治疗手段,但仍然存在其治疗效果不理想、副作用多且容易复发等问题[5]。

中医药在肝硬化腹水的防治中发挥了十分重要的作用,针对肝硬化腹水病因、病机、分期进行辨证论治,从而改善临床症状、提高生活质量、延长生存时间,取得了良好的疗效[6]。因此,有必要运用现代研究方法,对中药专利复方进行深入探索,研究它们之间的关联规则和配伍规律。本研究通过挖掘国家专利数据库中治疗肝硬化腹水的中药复方数据,分析其用药规律和配伍特点,确定核心药物,运用网络药理学筛选有效成分和治疗靶点,并进行富集分析,选取主要成分与核心靶点做初步的分子对接验证。我们探索和阐述了核心药物治疗肝硬化腹水的潜在分子机制,为其在临床的推广提供参考依据,为新药研发提供思路,整体研究思路如图1 所示。

图1 国家专利中药复方核心药物治疗肝硬化腹水的作用机制研究思路

1 材料与方法

1.1 复方数据来源 登录“国家知识产权局-中国专利公布公告”网站(https：//www.cnipa.gov.cn/),进入“高级查询”页面,勾选“发明公布”与“发明授权”,将“肝硬化腹水AND中药”作为“名称”进行检索,筛选结果后得到最终数据。检索时间范围为建库至2022年3月8日。

1.2 复方纳入与数据标准化 纳入国家专利数据库中治疗肝硬化腹水的全部中药复方专利;药物组成相同但用量不同的可重复录入,药物组成及用量相同的仅录入1次。排除外用复方,排除非中医药医疗类专利。依据2020年版《中国药典》、《中华本草》对中药名称进行规范化处理;按照《中药学》规范中药复方的药物功效类别。

1.3 数据关联规则与聚类分析 利用IBM SPSS Modeler 18.0软件,基于Apriori算法对已纳入的中药复方进行关联规则分析,设置同时满足最低条件支持度≥7,最小规则置信度百分比≥65,提升度>2的药物为治疗肝硬化腹水的常见药物。利用IBM SPSS Statistics 24软件中的组间联接聚类算法,对高频药物进行聚类分析。

1.4 中药复方专利核心药物化学成分与作用靶点挖掘 根据频次统计与关联规则,确定治疗核心中药。通过TCMSP数据库[7]挖掘核心药物的化学成分,设置化合物生物口服利用度(OB)≥30%、类药性指数(BL)≥0.18,筛选活性成分和蛋白靶点。此外,查阅文献添加已报道的化学成分和蛋白靶点。使用Uniport数据库[8]对蛋白进行名称规范转化操作。

1.5 肝硬化腹水潜在靶点获取 以“cirrhosis ascites”“cirrhotic ascites”为关键词分别在GeneCards 数据库和OMIM 数据库进行检索,获取肝硬化腹水相关靶点。

1.6 PPI网络构建及核心靶点筛选 将核心药物作用靶点和肝硬化腹水潜在靶点进行比对,得到作用靶点。将作用靶点导入String Version 11.5平台[9],选取分值>0.9分的高置信度区间,根据自由度值≥2倍中位数的靶点构建PPI 网络,筛选核心靶点。

1.7 核心药物-成分-靶点-疾病网络构建 将核心药物、化合物成分、核心靶点、疾病信息导入Cytoscape 3.8.0软件[10]绘制中药-成分-靶点-疾病网络图。

1.8 KEGG通路和GO功能富集分析 为进一步研究核心药物治疗肝硬化腹水的作用情况,使用和Metascape平台[11]对核心靶点进行KEGG信号通路和GO功能富集分析,结果以P值升序排列。

1.9 分子对接验证 根据质谱结果[12-17]和Degree值选出β-谷甾醇、常春藤皂苷元、毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA、异鼠李素、槲皮素、儿茶素、泽泻醇C作为核心药物的主要成分,与核心靶点做初步的分子对接验证。下载主要成分和靶点文件,配置Config 文件,运行Autodock vina1.1.2,计算分子对接结合能[18-20];在Open Babel GUL软件中将pdbqt格式文件转化为pdb格式文件,在PyMOL中打开pdb格式文件,运用PLIP网站[21]进行可视化分析。

2 结果

2.1 专利检索统计与分析 通过检索国家专利数据库,共获得专利139项,纳入符合标准的共110项。110项专利涉及药物456味,用药频次总计1 607次。其中使用频率≥10次的药物共40味,占总使用频次的44.18%,见表1。对频次≥10次的药物进行功效类别分析,发现各中药类别使用频率排名前4位的为：补虚药、利水渗湿药、活血化瘀药和理气药,多有补气健脾、利水渗湿、活血利湿、调理气机的作用,用药特点与鼓胀的基本病机“脾气虚弱、气滞、血瘀、水停”相符。

表1 110付治疗肝硬化腹水中药复方专利高频药物(≥10次)

2.2 关联规则与聚类分析 将40味高频药物导入IBM SPSS Modeler 18.0软件中,得出专利复方治疗肝硬化腹水在组方配伍时同时出现且频率较高的药物。关联规则结果以“后项→前项”展示,按支持度百分比由高到低排序。

2.2.1 设定最大前项数为2,得到关联规则89条,取前5条关联规则进行展示,见表2。结果显示二阶关联规则中支持度最高的为丹参-黄芪,三阶关联规则中支持度最高的为白术-黄芪-丹参。

表2 中药复方专利治疗肝硬化腹水药物关联分析表

2.2.2 根据数据挖掘结果,绘制高频药物关联规则web可视化布局图。通过线条粗细来表示药物配伍关系的强弱,线条越粗,药物之间的配伍关系越强。结果显示,强配伍关系为白术-茯苓,见图2。

图2 高频药物关联规则web可视化布局图

2.2.3 运用IBM SPSS Statistics 24软件中的组间联接聚类算法,对上述40味高频药物进行聚类分析,根据结果,可将中药组合分为6类,见图3。

图3 高频药物聚类分析树状图

2.3 核心药物作用化合物及靶点 根据频次统计与关联规则,确定白术、茯苓、黄芪、丹参、茵陈、大腹皮、泽泻为核心中药。综合文献报道及各数据库检索,化合物种类为：白术4种、茯苓13种、黄芪18种、丹参62种、茵陈11种、大腹皮3种、泽泻9种,去除重复后获得116个化合物,涉及作用靶点912个。

2.4 肝硬化腹水疾病潜在靶点 在GeneCards和OMIM数据库中分别找到肝硬化腹水相关靶点2 017和99个,去除重复靶点,共得到2 048个疾病靶点。

2.5 PPI网络构建及核心靶点筛选 将核心药物的912个靶点与肝硬化腹水潜在靶点取交集,得到核心药物治疗肝硬化腹水的作用靶点共331个,根据自由度筛选得到61个核心作用靶点。

2.6 构建核心药物-成分-靶点-疾病网络 将中药、化合物成分、核心靶点和疾病导入Cytoscape 3.8.0软件绘制中药-成分-靶点-疾病网络图。见图4。倒三角形表示核心药物,六边形表示化合物成分,菱形表示核心靶点,三角形表示肝硬化腹水疾病。

图4 核心药物-成分-治疗靶点-疾病网络图

2.7 KEGG通路和GO富集分析 将61个核心靶点导入Metascape平台进行KEGG通路富集分析,得到KEGG通路总计174条。排名靠前的通路主要有癌症相关途径、乙型肝炎、PI3K-Akt信号通路、丙型肝炎等,按P值对排名前20的通路绘制富集分析气泡图,见图5。

同时将这61个核心靶点导入Metascape平台进行GO富集分析,获得1 432条生物过程条目,71条细胞组分条目,105条分子功能条目。根据P值进行排序,选择生物过程前10条、细胞组分和分子功能前5条目绘制富集分析气泡图,见图6。GO富集分析可知,靶点蛋白主要参与了对生长因子的反应、蛋白质磷酸化的正调控、转录调节复合物、局灶性粘连、蛋白激酶活性、激酶结合等过程。

图6 GO生物过程、细胞组分以及分子功能富集分析气泡图

3.8 分子对接 将核心药物主要成分β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、常春藤皂苷元(Hederagenin)、毛蕊异黄酮(Calycosin)、丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)、异鼠李素(Isorhamnetin)、槲皮素(Quercetin)、儿茶素(+)-Catechin、泽泻醇C(Alisol C)与核心靶点SRC(1O43)、TP53(4CZ5)、HSP90AA1(1BYQ)、STAT3(6NJS)进行分子对接结合。一般而言,小分子配体与大分子受体结合的构象越稳定时能量越低,发生作用的可能性越大,对接结合能<-5 kcal/mol时说明可形成稳定的对接结构[22]。本研究结果显示,八种主要成分都能与核心靶点较好的结合,其中常春藤皂苷元与核心靶点结合最好,见表3,分子对接图见图7。

表3 核心药物主要成分与核心靶点对接结合能(kcal /mol)

3 讨论

根据肝硬化腹水的临床表现和病变特点,归属于中医“鼓胀”范畴,其病机为肝失疏泄、脾失健运、肾失气化,辨证分型为：气滞水停证、脾虚水停证、湿热水停证、血瘀水停证、脾肾阳虚水停证、肝肾阴虚水停证[6]。治疗肝硬化腹水多注重病机和症状治疗,临床多运用白术、茯苓、黄芪、丹参、大腹皮等药物。

本研究共纳入110项治疗肝硬化腹水的中药复方专利,包含456味药物。根据频次统计与关联规则,确定白术、茯苓、黄芪、丹参、茵陈、大腹皮、泽泻为核心中药。白术健脾益气、燥湿利水,发挥保肝、利胆等作用[12]。茯苓健脾、利水渗湿,发挥保肝、防治肝细胞坏死等作用[13]。黄芪补气升阳,发挥抗纤维化、保肝等作用[23]。丹参活血化瘀,具有防护肝细胞损伤、促进肝细胞再生、抗肝纤维化等作用[24]。茵陈利胆退黄,具有保肝、利胆、防治肝纤维化等作用[15]。大腹皮利水消肿、行气宽中,能兴奋胃肠道平滑肌。泽泻利水渗湿,发挥利尿、保肝、减轻肝脏脂肪性病变等作用[17]。7味核心药物中,白术、茯苓、黄芪、大腹皮、泽泻以补气健脾、利水渗湿为主,辅以丹参活血化瘀,茵陈清利湿热。

根据高频药物类别分析,占据前4类的是补虚药、利水渗湿药、活血化瘀药和理气药,这与核心药物分布一致。在治疗肝硬化腹水的专利复方中,常以补虚药为主,利水渗湿药、活血化瘀药和理气药为辅。根据高频药物聚类分析共得出6个聚类组合,聚4类：柴胡、青皮、白花蛇舌草、山楂、牡丹皮、鳖甲、当归、山药、黄精、虎杖、猪苓、薏苡仁、茵陈、枳壳、茯苓、泽泻、白术、党参,可视为柴胡疏肝散、五苓散、参苓白术散化裁而来,其功擅疏肝理气、健脾益气、化气利水、行水散满,适用于肝硬化腹水气滞水停和脾虚水停者。

分析PPI网络可知,核心靶点包括SRC、TP53、HSP90AA1和STAT3。SRC在肝纤维化中具有重要作用,SRC抑制剂可通过阻止肝星状细胞活化,降低结缔组织生长因子来治疗肝纤维化[25]。TP53是降低肝细胞癌风险的潜在候选物,其功能的丧失被认为是多阶段肝癌发生中最重要的一步[26]。STAT3与肝损伤、炎症、再生和肝细胞癌的发生发展密切相关[27,28]。不难发现,这些核心靶点主要参与肝纤维化、肝癌发生、肝损伤和肝硬化等过程,从而起到治疗肝硬化腹水的作用。

根据质谱结果和Degree值筛选核心药物的主要成分。β-谷甾醇广泛应于与肝脏疾病,具有抗炎、降脂、防止肝组织胶原过度累积、改善肝毒性肝脏损伤作用[29]。常春藤皂苷元可抑制肝癌细胞的生长,降低血糖,降低血脂[30]。在HepG2肝癌细胞中,毛蕊异黄酮可诱导线粒体依赖性凋亡和细胞周期停滞,并通过ROS介导的信号通路抑制细胞迁移,从而抑制肝癌细胞生长[31]。丹参酮ⅡA是从丹参根中分离得到的,具有抗纤维化、抗癌、抗氧化、抗炎等作用[32]。异鼠李素是一种保护肝脏的黄酮类化合物,可通过TGF- β1/Smad3通路抑制细胞外基质形成治疗肝纤维化[33]。槲皮素对各种急、慢性肝损伤均具有良好的防治作用[34]。研究表明,(+)-儿茶素和泽泻醇C均可改善肝脂代谢紊乱和肝损伤[16,17]。

分子对接结果显示,主要活性成分与核心靶点稳定结合,初步验证了上述网络药理学预测结果的可靠性。通路富集结果显示,核心药物可能通过乙型肝炎、PI3K-Akt信号通路、丙型肝炎等发挥作用。其中乙型肝炎和丙型肝炎信号通路与肝病直接相关;PI3K/Akt信号通路可转导调节细胞外基质降解、肝星状细胞活化和肝窦毛细血管化,在肝纤维化形成中起重要作用[35]。

但本研究仍存在一定局限性,基于国家专利数据库数据挖掘方法仅简单地统计分析出用药频次,未能充分考虑中医辨证分型的特点。获得的关键蛋白靶点和信号通路,未能采用体内外实验来验证其预测的准确性。因此,这些局限性有待课题组进一步完善和补充。