长非编码RNA LOC285194在宫颈癌中的表达及相关ceRNA网络的探究*

黄秋霞 欧海玲 黄克强 刘姗姗

广西中医药大学第一附属医院病理科,广西南宁市 530023

宫颈癌(cervical cancer,CC)是全球范围内最常见的妇科癌症之一,据统计,2020年共新增60.4万例CC,死亡病例34.2万例[1]。尽管HPV疫苗能在一定程度上预防宫颈上皮内瘤变和CC,但仍有部分CC的发生与HPV感染无关[2]。因此,开展CC的相关研究,探索与CC发生发展相关的机制十分必要。

长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类不编码蛋白质的RNA分子,近年来研究发现lncRNA参与转录后修饰,从而参与宫颈癌的发生发展[3-4]。LOC285194(又称TUSC7,LSAMP-AS3),是一个与肿瘤发展相关的lncRNA。研究表明,LOC285194在子宫内膜癌和卵巢癌的组织中低表达[5-6]。然而,鲜有研究探讨LOC285194在CC中的表达。一项研究揭示LOC285194在CC组织和患者血清中低表达[7],但缺乏多中心、大量样本的验证。因此,有必要利用大量样本进一步探究LOC285194在CC组织或细胞中的表达及相关的分子机制。

本研究检索GEO、TCGA、Array Express等数据库,收集多中心样本数据,探究lncRNA LOC285194在CC组织中的表达。同时,通过探究LOC285194在CC中相关的内源竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),进一步研究LOC285194在CC中的潜在分子机制。

1 材料和方法

1.1 数据获取及处理 截至2022年1月10日,通过检索GEO、ArrayExpress、SRA等数据库,筛选CC相关的高通量数据集。检索式如下:(cervical cancer or cervical carcinoma) and (mRNA or gene or miRNA or microRNA or lncRNA or lincRNA or long non-coding RNA)。数据集纳入标准:(1)样本来源于CC患者;(2)样本未做任何处理;(3)包含mRNA或lncRNA或miRNA表达数据;(4)CC组和非癌对照组的样本均≥3例;(5)有相应的探针注释文件。最终,纳入CC中lncRNA LOC285194相关数据集6个,分别为GSE6791、GSE27678、GSE63514、GSE75132、GSE145372、GSE167362。将来自同一平台的数据集合并,并用R语言(v4.0.4)软件包sva校正批次效应。同时,下载来自TCGA数据库CC患者的RNA测序数据,与GTEx数据库中的正常宫颈组织RNA测序数据合并。

此外,以相同方法收集了与CC相关的30个信使RNA(messenger RNA,mRNA)数据集和7个微小RNA(microRNA,miRNA)数据集(见表1)。利用R语言(v4.0.4)软件包meta计算每个mRNA和miRNA的标准化均数差(standard mean difference,SMD),满足SMD>0且P<0.05的被认为是CC中高表达的mRNA和miRNA;满足SMD<0且P<0.05的被认为是CC中低表达的mRNA和miRNA[8]。

表1 高通量数据集

1.2 LOC285194在CC组织与正常宫颈组织中的表达水平差异 在本研究中,通过散点图探索LOC285194在CC组织与正常宫颈组织中表达水平的差异,该过程借助软件GraphPad Prism 8完成。同时,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,通过曲线下面积(AUC)评估LOC285194区别CC组织与正常宫颈组织的能力。其中0.5

此外,为了综合评估LOC285194在CC组织与正常宫颈组织中的表达水平差异,利用Stata软件v15.1(TX,USA)计算所有包含LOC285194表达数据的高通量数据集的合并SMD值,当统计量I2<50%时,可以认为异质性较小,使用固定效应模型(fixed effects model)合并SMD值;当统计量I2≥50%时,使用随机效应模型(random effects model)合并SMD值。SMD值的判读标准同2.1所述[9]。同时,绘制综合受试者工作特征(summary receiver operating characteristics,SROC)曲线来综合评估LOC285194区别CC组织与正常宫颈组织的能力。

1.3 构建CC中LOC285194相关的ceRNA网络 利用在线工具DIANA-LncBase v3预测与LOC285194具有靶向关系的miRNA[10],并将预测获得的miRNA与计算获得的高表达miRNA取交集。同时,利用TargetScan Human v8.0预测miRNA的靶基因,将靶基因与计算获得的低表达mRNA取交集。软件Cytoscape v3.7.1用于绘制ceRNA网络图。此外,利用ENCORI数据库计算获取的miRNA与靶基因的相关性[11]。

1.4 统计学方法 独立样本t检验用于分析CC组织与正常对照之间LOC285194表达水平的差异。Pearson相关系数r用于评估miRNA与靶基因之间的相关性。在本研究中,P<0.05提示结果具有统计学意义。

2 结果

2.1 LOC285194在CC组织与正常对照的表达差异 本研究纳入的7个lncRNA数据集,经合并同一平台数据集后整理得到4个数据集。其中,2个数据集中检测到LOC285194在CC组织中的表达水平低于正常宫颈组织,且差异具有统计学意义(P<0.05;见图1a、d);2个数据集中检测到LOC285194在CC组与正常宫颈组织无统计学差异(P>0.05;见表1b、c)。ROC曲线提示LOC285194具有轻度到中度区分CC组织及正常对照组织的能力(AUC=0.581 4～0.777 8;见图1e～h)。进一步整合分析得出总SMD=-0.43(95%CI=-0.61～-0.25,P<0.05;见图2a),也支持LOC285194在CC组织中的表达显著低于正常宫颈组织,且发表偏倚无统计学意义(P>0.05;见图2b)。SROC曲线下面积为0.63,提示LOC285194具有轻度区分CC组织和正常宫颈组织的能力(见图2c)。

图1 LOC285194在CC组及其正常对照组的表达水平差异及LOC285194区分CC组织的能力a～d.LOC285194表达水平的散点图;P值基于独立样本t检验 e～h.LOC285194在各个数据集中的ROC曲线

图2 整合计算评估LOC285194在CC组织和正常对照组织中的表达水平差异及LOC285194区分CC组织的能力a.森林图提示,与正常对照组相比,LOC285194在CC组中表达下调 b.Egger’s检验提示结果无发表偏倚 c.SROC曲线提示LOC285194具有轻度区分CC组织的能力;SENS为敏感性;SPEC为特异性

2.2 LOC285194在CC中相关的ceRNA网络 通过将预测的miRNA与我们计算获得的高表达miRNA取交集,得到3个CC中与LOC285194有潜在关系的miRNA:hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-141-5p和hsa-miR-200a-5p。通过将TargetScan Human v8.0预测的靶基因与整合计算的低表达mRNA取交集,最终获得hsa-miR-130b-5p的17个靶基因、hsa-miR-141-5p的9个靶基因和hsa-miR-200a-5p的3个靶基因。将LOC285194和3个miRNA以及miRNA的靶基因一起绘制ceRNA网络图(见图3)。

图3 CC中LOC285194及其相关的ceRNA网络

2.3 CC中hsa-miR-141-5p与靶基因表达的相关性分析 选择hsa-miR-141-5p探讨其与靶基因表达的相关性。森林图提示,hsa-miR-141-5p在CC组织中的表达水平显著高于正常对照组织(SMD=1.95,95%CI=0.16～3.75,P<0.05;见图4a)。通过使用ENCORI,获得了hsa-miR-141-5p靶基因的Pearson相关系数(见表2)。挑选相关性最强的靶基因ZNF385D来探究其在CC组织与正常宫颈组织中表达水平的差异,森林图提示总SMD=-1.13(95%CI=-1.96～-0.31,P<0.05;见图4b),表明ZNF385D在CC组织中的表达水平显著低于正常宫颈组织。同时,利用TargetScan Human v8.0,预测了hsa-miR-141-5p与靶基因ZNF385D的结合位点情况(见图4c)。

图4 hsa-miR-141-5p及其靶基因ZNF385D在CC与正常对照之间的表达差异及互补序列a.森林图提示,与正常对照组相比,hsa-miR-141-5p在CC组中表达上调 b.森林图提示,与正常对照组相比,ZNF385D在CC组中表达下调 c.hsa-miR-141-5p与靶基因ZNF385D的结合序列;3’UTR,3’-端非翻译区;7mer-A1,与成熟miRNA种子区域的2-7位完全匹配且后跟碱基“A”

表2 hsa-miR-141-5p与靶基因在宫颈癌中的表达相关性

3 讨论

CC是女性生殖系统发病率较高的恶性肿瘤。除了众所周知的HPV感染,还有许多分子层面的改变也会影响CC的发生[1,12-14]。近年来,许多报道都揭示了lncRNA在CC中的作用[11,15]。LOC285194作为一个与肿瘤相关的lncRNA分子,其在多种肿瘤中的表达及生物学作用已被相继研究,但关于LOC285194在CC中的大样本研究较少。为此,本研究开展了CC相关的多中心样本分析。

LOC285194的低表达水平在多种恶性肿瘤组织或细胞系中被报道,如结直肠癌、胰腺癌、肺腺癌等[16-19]。对于女性生殖系统恶性肿瘤,LOC285194的低表达也在卵巢癌和子宫内膜癌组织中被验证[5-6],同时研究构建lncRNA LOC285194/miR-616/SOCS4轴的调控机制,证明LOC285194在卵巢癌和子宫内膜癌中发挥抑癌作用。一项研究报道了LOC285194在CC的癌组织和患者血清中均呈低表达水平[7]。与传统的研究方法不同,本研究收集了全球多中心与CC相关的数据集,通过618例样本(CC样本399例,正常宫颈样本219例),对比正常女性和CC患者宫颈组织中LOC285194表达水平的差异。来自多中心的样本(中国14例,美国448例,英国33例,德国28例)在一定程度上减少了人种对于研究结果的影响,同时整合计算SMD的方法减少了不同中心研究带来的偏倚,整合计算的结果显示与正常女性相比,CC患者宫颈组织的LOC285194呈低表达水平。结合已发表的研究,本研究推论LOC285194在女性生殖系统癌症中起到抑癌作用。

近年来的研究表明,ceRNA在肿瘤的发生、增殖、转移中起到了重要的作用,甚至可能成为治疗的靶点[20-23]。然而,还未有研究报道CC中LOC285194相关的ceRNA机制。本研究通过结合在线工具预测和大样本量的计算,发现了三个与LOC285194可能有靶向关系的miRNA:hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-141-5p和hsa-miR-200a-5p,并构建了相关的ceRNA网络。

此前,从未有研究探讨hsa-miR-141-5p及其靶基因ZNF385D在CC组织及相应正常对照中的表达水平差异。本研究通过收集多中心样本,利用402例样本(357例CC,45例正常宫颈组织)验证了hsa-miR-141-5p在CC组织中表达上调;同时利用1 098例样本(753例CC,345例正常宫颈组织)验证了ZNF385D在CC组织中的表达显著低于正常宫颈组织。LOC285194可能通过hsa-miR-141-5p/ZNF385D轴在CC中发挥调控作用,有待体外细胞实验验证。

综上所述,本研究首次利用全球多中心样本揭示了lncRNA LOC285194在CC患者的宫颈组织中呈低表达状态,LOC285194在CC中可能起抑癌作用。然而,LOC285194在CC中的分子机制及其临床病理意义仍需体内外实验探究。