高效液相色谱法同时测定五味子中的4种木脂素成分

唐琪 欧阳云 和薛 王辉 郑济芳 徐小娜

【摘要】目的：建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定五味子中五味子醇甲等4种木脂素成分的含量。方法：采用Sepax C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱，甲醇-乙腈-水流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长220 nm。结果：五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分别在0.365～13.194 mg/g、0.388～14.853 mg/g、0.442～16.630 mg/g、0.313～ 11.882 mg/g浓度范围内呈良好的线性关系，回收率、精密度、稳定性等试验结果均符合方法学测定要求。12批不同产地五味子的4种木脂素成分含量有差异，RSD为0.76%～3.28%。结论：建立的高效液相色谱法可用于同时分析五味子中的4种木脂素成分。

【关键词】五味子；高效液相色谱法；五味子醇甲；五味子酯甲；五味子甲素；五味子乙素

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.03.034

【基金項目】广西自然科学基金项目（2020JJA140132）；广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2023KY0527）；桂林医学院人才引进科研项目（20501020028）。

The Simultaneous Determination of Four Lignans in Schisandra Chinensis by HPLC

TANG Qi1，OUYANG yun1，HE Xue1，WANG Hui2，ZHENG Jifang1，XU Xiaona1，3*

（1.SGuilin Medical College〔School of Public Health〕，Guilin 541199，China；2.South China University〔School of Public Health〕，Hengyang 421001，China；3.The Guangxi Key Laboratory of Environmental Exposomics and Entire Lifecycle Health，Guilin 541199，China）

Abstract：Objective：To establish a high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination Schizandrol A and other three lignans in Schisandra Chinensis. Methods：HPLC separations were carried out on a Sepax C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm）by gradient elution using methanol，acetonitrile and water as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min，and the column temperature was 30℃. The injection volume was 20μL and the detection wavelength was 220 nm. Results：The linear relationships of Schizandrol A，Schisantherin A，Schizandrin A and Schizandrin B were good within the ranges of 0.36～13.20，0.39～ 14.86，0.44～16.63，and 0.32～11.88 mg/g，relatively. The results of recovery，precision，stability and so on all met the requirements of methodological determination. The content of the four lignans tested in 12 batches of Schisandra Chinensis samples from different producing areas was different，with the RSD of 0.76%～3.28%. Conclusin：The established method can be applied to determine the four lignans in Schisandra Chinensis simultaneously.

Key words：Schisandra Chinensis；HPLC；SchizandrolA；SchisantherinA；SchizandrinA；Schizandrin B

五味子为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果实，具有益气生津、收敛固涩、补肾宁心等功效[1]，属我国传统中药材。现代研究表明，木脂素为五味子主要的生物活性成分，具有保护肝脏、延缓心肌和血管重构、抗炎及免疫调节等广泛的药理作用[2]。目前，已从五味子中分离得到约50个木脂素类成分，且不同木脂素单体成分具有不同的功效[3]。其中，五味子醇甲具有明显的镇痛[4]、抗惊厥和抗抑郁[5]、镇静催眠、抗癌、抗炎、保护肝细胞和抗自由基活性等作用[6]；五味子酯甲具有止咳、镇静、抗炎、抗肿瘤作用[7]；五味子甲素对胶质细胞瘤有较好的增殖抑制作用[8]；五味子乙素具有抗氧化、抗炎、护肝、抗肿瘤等功效[10]。2020年版《中华人民共和国药典》规定以五味子醇甲的含量作为五味子药材及饮片质量控制的指标，显然单一指标成分的含量测定不能全面反映药材的质量状况。

为提高中药材的质量标准，确保其疗效稳定，本文采用高效液相色谱法（HPLC）对五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等4种木脂素成分同时进行分析。

1实验材料

1.1仪器和试剂

戴安高效液相色谱仪LC-20A，KQ-3200DF超声仪清洗器（昆山超声仪器公司，中国），万能粉碎机，中沃水务超强型超纯水器，远红外干燥箱，冰箱，120目筛。

五味子醇甲（批号110857-201412）、五味子酯甲（批号1529-200001）、五味子甲素（批号110764-201714）、五味子乙素（批号110765-201512）均购于湖南省食品药品检定所。分析纯无水甲醇、分析纯无水乙醇、HPLC级甲醇、HPLC级乙腈均购于江苏汉邦科技有限公司，水为二次去离子水（自制）。

1.2样品信息

实验所用五味子药材均为2019年产，经中南大学湘雅医院药学部刘韶教授鉴定为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實。样品信息见表1。

2方法与结果

2.1色谱条件

采用Sepax C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；柱温：30℃；进样量：20μl；流速：1.0 ml/min；检测波长：220 nm。流动相：乙腈（A）-水（B）-甲醇（C），梯度洗脱（0～20 min，A 30%，B 40%；20.1～30 min，A 30%→35%，B 40%→35%；30.1～40 min，A 35%→45%，B 35%→25%；40.1～50 min，A 45%，B 25%；50.1～60 min，A45%→30%，B 25%→40%）。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液制备

分别精密称定四种对照品适量，加甲醇配制成各种标准储备液：五味子醇甲（0.7400 mg/mL）、五味子酯甲（0.5000 mg/ mL）、五味子甲素（1.4000 mg/mL）、五味子乙素（0.3000 mg/ mL），于4℃冰箱冷藏、备用。临用前制备成标准应用液。

2.2.2样品溶液制备

精密称取五味子粉末0.25 g置于25 mL具塞比色管中，精密加入90 %甲醇4.00 mL，超声提取3次，每次提取20 min，过滤，合并三次滤液，定容，摇匀，冷藏备用。

2.3方法学考察

2.3.1专属性

取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂进样检测。结果显示，在样品及对照品出峰处溶剂无干扰，表明方法的专属性良好。

2.3.2线性关系

取混合对照品储备液适量，制备成一系列不同浓度的标准溶液，平行进样2次，以标准溶液浓度X对峰面积Y进行线性回归，以信噪比为3倍确定检测限，色谱图如图1（A）所示，结果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分别在0.365～13.194 mg/g、0.388～14.853 mg/g、0.442～16.630 mg/g、0.313～11.882 mg/g浓度范围内呈良好的线性关系，r值均在0.9997～0.9999，回归方程分别为y=96822x-0.5182、y=89233x-0.6938、y=73700x-0.6239和y=124166x-0.8712。表明各对照品在各自浓度范围内线性良好。

2.3.3精密度

对同一样品在日内连续进样6次，得日内精密度，在连续三天内分别测定6次得日间精密度。结果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD值小于5.0%，表明方法的精密度良好。

2.3.4稳定性

取同一供试品溶液分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，计算。五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积RSD分别为1.08%、1.12%、1.47%和1.22%，表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5重复性

取同一样品，精密称取5份，按“2.2.2样品溶液制备”项下方法制备样品溶液，平行测定，计算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素平均峰面积，所得RSD值均小于2.0%，表明方法重复性良好。

2.3.6回收率

称取已知含量的五味子药材细粉6份，分别精密加入等量对照品，按“2.2.2样品溶液制备”项下方法制备供试品溶液，测定，计算，结果平均回收率为98.31%～99.08%之间，RSD<2.8%，表明方法的准确性良好。

2.4样品测定

在优化的条件下分析样品，利用回归方程计算样品中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，代表性的色谱图如图1（B）所示。样品分析结果见表2。

3讨论

3.1色谱柱选择

考察了样品在Phenomenex LUNR C18、Agilent XDB-C8、Sepax C18及依利特Hypersil ODS C18等色谱柱，发现本实验中Sepax C18分离效果最好。

3.2流动相选择

试验了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水等不同系统流动相，发现以甲醇-乙腈-水梯度洗脱时，峰形、分离效果均最佳。

3.3提取溶剂选择

木脂素属极性偏大的化学成分。以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的总提取率为考察指标，分别用甲醇、乙醇及二者不同比例的水溶液进行提取。结果表明，以90%甲醇为提取溶剂时，目标物的总提取率最高，且提出的色素等杂质的含量较少。

3.4提取方法选择

选定提取溶剂后，考察了超声提取20 min、30 min、40 min，回流提取30 min、40 min、50 min，以及浸渍法等方法的提取效果。结果表明，超声提取30 min为最优的提取方法。

3.5检测波长选择

采用DAD检测器对样品溶液在200～400 nm波长范围内扫描，采集光谱图，结果发现各目标物质在220 nm均有较好的吸收，因此选择220 nm作为最终检测波长。

本文建立了同时测定五味子中4种木脂素成分的HPLC分析方法。方法专属性强、重复性好、简单高效，可为五味子药材的质量控制提供参考。12个不同产地的五味子药材中4种木脂素成分的含量的RSD为0.76%～3.28%，总提取率的RSD值为3.70%，表明各药材所含木脂素成分存在一定差异，这可能与药材产地的地质、水源及气候条件有关，更确切的原因以及由不同产地药材木脂素成分的差异引起的药理药效上的不同需要进一步分析研究。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]张明晓，黄国英，白羽琦，等.南、北五味子的化学成分及其保肝作用的研究进展[J].中国中药杂志，2021，46（5）：1017-1025.

[3]朱琳，侯丽华，刘亮亮，等.五味子药材提取工艺优化及8个木脂素类成分含量测定[J].中国现代中药，2022，24（5）：861-867.

[4]邢楠楠，屈怀东，任伟超，等.五味子主要化学成分及现代药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2021，27（15）：210-218.

[5]黄雅平，程晶，张小燕.五味子醇甲对小鼠抑郁行为的影响[J].中国药物经济学，2020，15（9）：49-52.

[6]白晓蕾，宋琳，郑远武，等.五味子醇甲药理研究进展[J].实用中医内科杂志，2021，35（2）：18-20.

[7]付亚东，陈佳美，刘伟，等.五味子酯甲对肝脏药物代谢酶的调节及药理作用的研究进展[J].中药新药与临床药理，2020，31（6）：741-748.

[8]石志強，钟红，王蛟龙，等.五味子甲素的体内药动学及药理活性研究进展[J].中国药师，2022，25（2）：316-320.

[9]张译敏，王雪妮，庞宇舟，等.五味子乙素抗肿瘤作用研究进展[J].中医药导报，2021，27（3）：180-184.

【作者简介】

唐琪，女，1996年出生，硕士，研究方向为健康相关物质分析。通讯作者：徐小娜，女，1974年出生，副教授，硕士生导师，研究方向为复杂体系多组分成分分离分析。联系电话：0773-3680605。

（编辑：侯睿琪）