气相色谱法测定乙酸阿比特龙中1，1，3，3-四甲基胍

2023-07-20宋小飞王红芳张辉申晓婷柴青叶游蓉丽

化学分析计量 2023年6期

宋小飞，王红芳，张辉，申晓婷，柴青叶，游蓉丽

（山西振东制药股份有限公司，山西长治 046000）

乙酸阿比特龙，化学名称为17-(3-吡啶基)-雄甾-5，16-二烯-3β-乙酸酯，是一种口服CYPI7-A1 抑制剂，通过抑制酶活性从而阻止睾酮合成，与泼尼松联用，主要用于转移性去势抵抗性前列腺癌和转移性高风险前列腺癌的治疗[1‒4]。

1，1，3，3-四甲基胍是一种挥发性胺类，而挥发性胺类常用作乙酸阿比特龙合成过程中的催化剂，可以改变反应体系的pH 值，控制反应速度，提高产品收率[5‒6]。由于1，1，3，3-四甲基胍具有一定的毒性[7]，需控制其在药物中的含量。

胺类主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱联用法进行测定[8‒11]。胺类具有较强碱性，在进样系统和色谱柱中有较强的表面吸附，从而导致色谱峰拖尾、重复性差、灵敏度低。解决这一问题的方法主要是采用特殊色谱柱及衬管、衍生化、添加无机盐等[12‒14]。目前采用气相色谱法测定1，1，3，3-四甲基胍已有文献报道[12]，是以乙腈为溶剂溶解样品。而乙酸阿比特龙原料药在乙腈中溶解度较低，无法满足检测要求，笔者通过优化溶剂克服了1，1，3，3-四甲基胍测定过程中色谱峰拖尾和重复性差的问题[15‒17]，建立了气相色谱法测定乙酸阿比特龙中1，1，3，3-四甲基胍的方法，为化学原料药中1，1，3，3-四甲基胍的质量控制提供了技术参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：GC 7890B 型，配有氢火焰离子化(FID)检测器，美国安捷伦科技有限公司。

电子分析天平：TB-215D 型，感量为0.01 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

乙酸阿比特龙样品：批号为2109201，山西振东泰盛制药有限公司。

乙酸乙酯：色谱纯，北京百灵威科技有限公司。

N-甲基吡咯烷酮：色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

N，N-二甲基甲酰胺：色谱纯，北京伊诺凯科技有限公司。

N，N-二甲基乙酰胺：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司。

苯甲醇：色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1，1，3，3-四甲基胍：含量(质量分数)为99%，上海麦克林生化科技有限公司。

高纯氮气、高纯氢气：纯度均为99.999%(体积分数)，山西省长治炬能化工气体有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：CP-Volamine 型毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.45 μm，美国安捷伦科技有限公司)；载气：高纯氮气；进样口温度：250 ℃；检测器：FID；检测器温度：300 ℃；柱温：160 ℃；柱流量：2.0 μL/min；进样方式：溶液直接进样，分流比为10∶1；进样体积：1 μL；定量方法：色谱峰面积外标法。

1.3 溶液配制

1，1，3，3-四甲基胍对照品贮备液：1 mg/mL，精密称取1，1，3，3-四甲基胍0.05 g，置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至标线，摇匀。

1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液：0.1 mg/mL，精密量取1，1，3，3-四甲基胍对照品贮备液0.5 mL，置于5 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至标线，摇匀。

乙酸阿比特龙样品溶液：0.1 g/mL，精密称取乙酸阿比特龙样品0.5 g，置于5 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀释至标线，摇匀。

乙酸阿比特龙加标样品溶液：精密称取乙酸阿比特龙0.5 g，置于5 mL 容量瓶中，加入1，1，3，3-四甲基胍对照品贮备液0.5 mL，用乙酸乙酯溶解并稀释至标线，摇匀。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱选择

将1，1，3，3-四甲基胍溶于乙酸乙酯中，制成0.1 mg/mL 的1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液，采用溶液直接进样进行气相色谱法测定，分别考察不同极性色谱柱(DB-1、DB-5、DB-624、DB-FFAP)对1，1，3，3-四甲基胍定量分析的影响。结果显示，在4 种不同极性色谱柱中1，1，3，3-四甲基胍均拖尾严重，无法进行定量分析。这是由于1，1，3，3-四甲基胍有较强的碱性，容易吸附于色谱柱而导致拖尾严重[12]。随后考察了用于胺类分析的CP-Volamine型毛细管色谱柱，结果显示1，1，3，3-四甲基胍色谱峰对称度较好，拖尾因子小于2.0，故选用CP-Volamine 色谱柱。

2.2 色谱条件优化

由于该方法为单成分1，1，3，3-四甲基胍的测定，柱温程序宜采用等温分析。将1，1，3，3-四甲基胍溶于乙酸乙酯中，制成0.1 mg/mL 的1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液。分别设置柱温为140、150、160 ℃，考察不同柱温时1，1，3，3-四甲基胍的色谱峰面积、峰高、理论塔板数及拖尾因子，结果见表1。由表1可知，随着柱温升高，1，1，3，3-四甲基胍色谱峰高增大，灵敏度增加，拖尾因子降低，理论塔板数增大，柱效增高，有利于1，1，3，3-四甲基胍的分析，由于1，1，3，3-四甲基胍沸点为160 ℃，柱温不宜过高，故选择柱温为160 ℃。

表1 不同柱温时1，1，3，3-四甲基胍的色谱峰面积、峰高、理论塔板数及拖尾因子

2.3 溶剂选择

将1，1，3，3-四甲基胍溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制成0.1 mg/mL 的1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液。取适量的乙酸阿比特龙，溶于N，N-二甲基甲酰胺中，配制成0.1 g/mL 的乙酸阿比特龙样品溶液。采用溶液直接进样法，按1.2色谱条件考察方法的系统适用性与定量准确度。结果显示，色谱柱中1，1，3，3-四甲基胍会产生残留，影响后续样品测定。依据中国药典(四部)9102 药品杂质分析指导原则[14]，将1，1，3，3-四甲基胍控制限度确定为0.1%。按1，1，3，3-四甲基胍限量的50%、100%、150%制备9 份样品溶液，并进行测定，1，1，3，3-四甲基胍回收率为128.1%～158.7%，表明方法准确度较差，不适用1，1，3，3-四甲基胍的定量分析，这可能是溶剂N，N-二甲基甲酰胺的基质效应较大所致。

分别考察N，N-二甲基乙酰胺、苯甲醇、N-甲基吡咯烷酮、乙酸乙酯作为溶剂对1，1，3，3-四甲基胍测定结果的影响，分别用上述4 种溶剂稀释1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液，使其质量浓度均为0.1 mg/mL，按1.2 色谱条件进行分析，比较其色谱峰面积、峰高、理论塔板数、拖尾因子和分离度，结果见表2。

表2 不同种溶剂时1，1，3，3-四甲基胍的色谱峰面积、峰高、理论塔板数、拖尾因子及分离度

结果表明，采用苯甲醇作为溶剂时，苯甲醇中杂质峰与1，1，3，3-四甲基胍色谱峰保留时间一致，影响1，1，3，3-四甲基胍测定；N-甲基吡咯烷酮中存在与1，1，3，3-四甲基胍色谱峰相邻的杂质峰，分离度为1.4，无法与1，1，3，3-四甲基胍色谱峰有效分离，进行方法优化的空间较小，不适合作为溶剂；而N，N-二甲基乙酰胺分子结构及物理性质与N，N-二甲基甲酰胺相似，且对照品溶液会发生残留，影响后续进样分析，故不适合作为溶剂；采用乙酸乙酯作为溶剂时，1，1，3，3-四甲基胍色谱峰响应值较高，理论塔板数不小于5 000，拖尾因子不大于2.0，分离度不小于1.5，对照品溶液进样后无残留，故采用乙酸乙酯作为溶剂。

2.4 系统适用性与专属性试验

按照1.2 色谱条件，分别对溶剂空白、1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液、乙酸阿比特龙加标样品溶液进行测定，色谱图如图1所示。结果表明，1，1，3，3-四甲基胍色谱峰理论塔板数大于5 000，与相邻色谱峰分离度大于1.5，拖尾因子小于2.0，样品基质不干扰1，1，3，3-四甲基胍测定。

图1 溶剂空白、对照品溶液和加标样品溶液色谱图

2.5 线性方程与检出限

精密量取一定量1，1，3，3-四甲基胍对照品贮备液，用乙酸乙酯稀释成适宜质量浓度的溶液，在1.2色谱条件下分别测定，以信噪比为3 确定方法检出限，以信噪比为10确定定量限。

以定量限为起始浓度，分别精密量取1，1，3，3-四甲基胍对照品贮备液0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于5 只10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至标线，摇匀，配制成系列标准工作溶液，在1.2色谱条件下分别测定，以质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，计算线性方程、相关系数。

1，1，3，3-四甲基胍质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限结果见表3。由表3可知，1，1，3，3-四甲基胍在质量浓度为10.22～204.38 µg/mL 范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性相关系数为0.999 4，方法检出限为3.07 µg/mL，定量限为10.22 µg/mL。

表3 质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限与定量限

2.6 加标回收与精密度试验

精密称取乙酸阿比特龙样品9 份，分别加入适量的1，1，3，3-四甲基胍对照品贮备液，配制成低、中、高三种不同质量浓度的加标样品溶液，在1.2 色谱条件下分别测定，结果列于表4。由表4可知，1，1，3，3-四甲基胍的回收率为97.9%～113.3%，平均回收率为107.5%，9 份样品测定结果的相对标准偏差为5.0%，表明方法的准确度、精密度均较高。

表4 加标回收与精密度试验结果

2.7 溶液稳定性试验

取1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液、乙酸阿比特龙样品溶液、乙酸阿比特龙加标样品溶液，分别在配制完成后第0、4、8、12、16、20、24 h进样分析，结果见表5。由表5可知，1，1，3，3-四甲基胍对照品溶液室温放置24 h，1，1，3，3-四甲基胍的平均色谱峰面积为63.19，色谱峰面积的相对标准偏差为1.47%；乙酸阿比特龙样品溶液放置24 h，均未检出1，1，3，3-四甲基胍；乙酸阿比特龙加标样品溶液放置24 h，1，1，3，3-四甲基胍的平均色谱峰面积为62.34%，相对标准偏差为4.86%，表明对照品溶液、乙酸阿比特龙样品溶液、乙酸阿比特龙加标样品溶液室温放置24 h，稳定性良好。