表面增强拉曼光谱法快速检测西红花中5种酸性色素

2023-07-20刘丛丛陈钟罗文静梁蔚阳

化学分析计量 2023年6期

刘丛丛，陈钟，罗文静，梁蔚阳

（1.广东省药品检验所，国家药品监督管理局药品快速检验技术重点实验室，国家药品监督管理局血液制品质量控制重点实验室，广东省药品监督管理局血液制品质量控制研究重点实验室，广州 510663；2.广东安瑞生物科技有限公司，广州 510663）

西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头，有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效[1]。西红花原产地在伊朗、西班牙等国，我国河南、江苏等地也有引种栽培，但面积及产量有限。近年来西红花市场销售旺盛，部分不法商家在经济利益驱使下，通过染色造假牟取利益，严重影响了西红花的质量和用药安全。西红花染色所用染料多为人工合成色素，具有致癌性、致突变性和其它毒性，对人体会造成不同程度的危害[2]。并且劣质药材药效欠佳，达不到预期，导致贻误治疗加重病情[3]。我国对中药材染色掺伪的研究始于20世纪80年代，国家食品药品监督管理局为了加强对中药材染色掺伪的监督和打击，2003年起发布了一系列药品检验补充检验方法和检验项目批准件[4‒5]。

近年来，针对中药材染色掺伪鉴别的化学检测方法不断趋于完善，主要包括薄层色谱(TLC)法[3]、液相色谱(HPLC)法[6]、拉曼光谱法[7]、离子迁移谱技术法[8]、色谱-质谱联用(HPLC-MS)法[9‒10]、近红外光谱(NIRS)法[11]等。其中薄层色谱法操作简单，成本较低，但需要典型掺伪染料进行随行对照；高效液相色谱及质谱联用等技术检测灵敏度高、准确度好，已成为实验室内中药材染色掺伪检测的主流方向，但成本高，样品预处理复杂，不适合现场检测；离子迁移谱技术、近红外光谱及拉曼光谱法，以其专属性强、分析时间短的特点，成为中药材染色掺伪鉴别的研究热点。而表面增强拉曼光谱(SERS)借助于纳米结构金属基底的表面等离激元诱导的表面电磁场的增强效应，兼具指纹识别、现场检测和表面增强的优点，已成功应用于中药材真伪鉴别、中药材生化分析、中药材产品质量监控[12‒14]、人工合成色素等痕量目标物的高灵敏度检测[15]中。

西红花自身的类胡萝卜素颜色鲜艳，往往干扰测定，导致色素的检测不准确，目前一般采用薄层色谱法[16]、固相萃取小柱过滤[17]等样品预处理方法来减少干扰，然而此类方法存在步骤繁琐，且一般需要多种有机试剂等问题，不利于样品快速检测。因此，急需建立一种样品预处理简单、专属性强、成本低且检测速度快的方法，填补西红花染色掺伪快速鉴别的技术空白。

笔者以西红花中5种常见禁限用酸性色素为目标成分，通过优化样品处理条件，建立了SERS法快速检测西红花中诱惑红、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙5种酸性色素。该方法实现了西红花中5种酸性色素的快速检测，解决了样品预处理复杂、检测耗时长、成本高等问题，可有效提高对西红花染色掺伪的风险监测，保护广大消费者的用药安全。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

便携式拉曼光谱仪：Thermo First Defender RM型，美国赛默飞世尔科技公司。

液相色谱-质谱联用仪：Triple Quad5500 型，美国AB SCIEX公司。

氮吹仪：Lab Tech M32型，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

电子天平：METTLER MS205DU/S204DU 型，感量为0.000 1 g，瑞士梅特勒-托利多公司。

诱惑红标准溶液：质量浓度为0.5 mg/mL，编号为GBW(E) 100164，中国计量科学研究院。

日落黄标准溶液：质量浓度为0.5 mg/mL，编号为GBW(E) 100003，中国计量科学研究院。

苋菜红对照品：质量分数为94.4%，北京曼哈格生物技术公司。

胭脂红标准溶液：0.5 mg/mL，编号为GBW(E)100004，中国计量科学研究院。

酸性橙Ⅱ对照品：质量分数为98.3%，北京曼哈格生物技术公司。

甲醇：色谱纯，美国Honeywell公司。

乙酸铵：色谱纯，美国ROE公司。

乙酸：色谱纯，美国Supelco公司。

氨水：色谱级，上海阿拉丁公司。

酸性色素试剂盒：货号为SERS-F0705，厦门谱识科仪股份有限公司。

胶体金表面增强试剂：厦门谱识科仪股份有限公司。

实验室用水为超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm。

氮气：由Lab Tech M32型氮吹仪自制。

西红花样品：共30批，自编号为x-001～x-030，市售。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

苋菜红、酸性橙Ⅱ标准储备溶液：分别精密称取苋菜红、酸性橙Ⅱ对照品各10 mg，用甲醇配制成质量浓度均为0.5 mg/mL 的标准储备溶液，于4 ℃冷藏保存。

5种色素标准工作溶液：分别精密吸取诱惑红、日落黄、胭脂红标准溶液及苋菜红、酸性橙Ⅱ标准储备液，用体积分数为10%的甲醇水溶液稀释至胭脂红的质量浓度为1 μg/mL，日落黄、酸性橙Ⅱ、苋菜红的质量浓度均为5 μg/mL，诱惑红的质量浓度为10 μg/mL的标准工作溶液。

1.2.2 样品溶液制备

(1) SERS 检测样品溶液：称取西红花样品0.1 g于15 mL离心管中，加入5 mL体积分数为50%的甲醇水溶液，振荡30 min，以4 000 r/min 离心10 min，用一次性吸管取出上清液于15 mL 离心管中，于55 ℃氮吹至约1 mL，加水至10 mL，涡旋混匀，即为SERS检测西红花样品溶液。

(2) LC-MS/MS检测样品溶液：称取西红花样品0.1 g于15 mL离心管中，加入5 mL体积分数为50%的甲醇水溶液，振荡30 min，以4 000 r/min 离心10 min，用一次性吸管吸取上清液于15 mL 离心管中，于55 ℃氮气吹干，用5 mmol/L乙酸铵-甲醇(体积比为90∶10)稀释至10 mL，经聚四氟乙烯滤膜(0.22 μm)过滤。

1.2.3 SERS检测方法

取200 μL 增强试剂CP-1 于拉曼样品池中，加入50 μL凝聚剂I (酸性色素试剂盒中试剂)混匀，再加入50 μL 待测样品溶液，混匀，于5 min 内放入拉曼光谱仪检测分析。

1.2.4 SERS检测条件

激发光源波长：785 nm；激光光源功率：250 mW；曝光时间：50 ms；扫描延迟：0 s；光谱采集范围：400～2 000 cm-1。

1.2.5 LC-MS/MS检测条件

(1) 色谱条件。色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵(pH 5.9)，B为甲醇，流量为0.3 mL/min，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

(2) 质谱条件。离子源：电喷雾离子源；扫描模式：负离子模式(ESI-)；检测方式：全扫描；碰撞气：氮气，压力为62 kPa；气帘气：氮气，压力为276 kPa；离子喷射电压：-4 500 V；离子源温度：550 ℃；离子气1：氮气，压力为379 kPa；离子气2：氮气，压力为379 kPa。5种色素的质谱定性分析参数见表2。

表2 5种色素质谱定性分析参数

1.3 结果判定

1.3.1 SERS法结果判定

按照1.2.3 检测方法，在1.2.4 SERS 检测条件下，分别检测5种色素标准工作溶液，将所得的表面增强拉曼光谱图于仪器软件中建立色素标准库。通过对样品的表面增强拉曼光谱图中特征峰与色素标准库中的特征峰比对，分析判断试样中是否含有上述5 种色素，特征峰一致则可判定试样中含有此色素组分。

1.3.2 LC-MS/MS法结果判定

对拉曼光谱法检测结果为阳性的样品，采用1.2.5 中的LC-MS/MS 法进一步定性确证。在相同实验条件下，样品的色谱峰保留时间与对照品保留时间一致，且样品二级质谱图中的选择分子离子峰及特征碎片离子峰与表2 中对照品均一致，则可以判断样品中存在对应的组分。

2 结果与讨论

2.1 SERS光谱图

2.1.1 5种酸性色素标准溶液的SERS光谱图

5 种酸性色素标准溶液的SERS 光谱图如图1所示。

图1 5种色素标准工作溶液的SERS光谱图

诱惑红特征峰为748、1 226、1 272、1 324、1 408、1 502、1 580 cm-1，其中748 cm-1为C—C 环对称弯曲振动和C—H伸缩振动，1 226 cm-1为—SO2—对称伸缩振动，1 272 cm-1为萘环和苯环上C—O 表面伸缩振动，1 324 cm-1为苯环上O—H 变形振动，1 408 cm-1为偶氮结构—N=N—弯曲振动，1 502 cm-1为萘环和苯环上—C=C—伸缩振动，1 580 cm-1为诱惑红分子中—C—C—伸缩振动[18]。

日落黄特征峰为468、986、1 123、1 178、1 229、1 335、1 389、1 499、1 596 cm-1，其中468 cm-1为萘环和苯环面外摆式振动，986 cm-1为萘环面内剪式振动和C—H 面外扭式振动，1 123 cm-1为—SO3—C—伸缩振动和C—H面外摆式振动，1 178 cm-1为C—H面内剪式振动，1 229 cm-1为C—O—H 面外摆式振动和C—H 面内剪式振动，1 335 cm-1为苯环非对称伸缩振动，1 389 cm-1为萘环非对称伸缩振动和C—O—H 面外摆式振动，1 499 cm-1为C—H 面外摆式振动和苯环面内剪式振动，1 596 cm-1为萘环和苯环对称伸缩振动[19]。

苋菜红特征峰为715、940、1 177、1 232、1 346、1 365、1 483、1 515、1 574 cm-1，其中715 cm-1为C—S 伸缩振动，940 cm-1为对称C—O—C 伸缩振动，1 177 cm-1为CH2扭曲和摆动，1 232 cm-1为苯环振动，1 346 cm-1和1 365 cm-1为C—H 形变振动，1 483 cm-1为CH3•CH2形变振动，1 515 cm-1和1 574 cm-1为苯环拉伸振动[20]。

胭脂红特征峰为1 237、1 298、1 361、1 440、1 513、1 571、1 591 cm-1，其中1 237 cm-1为C—H 面内摆式振动和C—O—H 面内剪式振动，1 298 cm-1为C—O—H和C—H面内剪式振动，1 361 cm-1为萘环非对称伸缩振动，1 440 cm-1为萘环非对称伸缩振动和C—H面内摆式振动，1 513 cm-1为—N=N—伸缩振动，1 571 cm-1为萘环非对称伸缩振动、—N=N—伸缩振动和C—H 面内摆式振动，1 591 cm-1为萘环对称伸缩振动和C—H面内剪式振动[19]。

酸性橙Ⅱ特征峰为986、1 121、1 170、1 229、1 386、1 417、1 499、1 596 cm-1，其中986 cm-1为萘环面内剪式振动和C—H 面外扭式振动，1 121 cm-1为SO3—C伸缩振动和C—H面外摆式振动，1 170 cm-1为C—H面内剪式振动，1 229 cm-1为C—O—H面外摆式振动和C—-H面内剪式振动，1 386 cm-1为萘环非对称伸缩振动和C—O—H 面外摆式振动，1 417 cm-1为苯环非对称伸缩振动和C—H面内剪式振动，1 499 cm-1为C—H面外摆式振动和苯环面内剪式振动，1 596 cm-1为萘环和苯环对称伸缩振动[19]。

2.1.2 实际样品的SERS光谱图

阴性样品(编号为：x-003)的SERS光谱图如图2所示。

图2 阴性样品的SERS光谱图

将阳性样品(编号为：x-001、x-005、x-006)的SERS 光谱图与胭脂红标准溶液的SERS 光谱图叠加，如图3 所示。由图中可以看出，样品x-001、x-005、x-006 均可检测到胭脂红的特征峰，为阳性样品。

图3 阳性样品与胭脂红标准溶液的SERS光谱图

2.2 样品制备方法优化

2.2.1 取样量优化

当阴性样品取样质量为0.05～1 g时，分别移取0.1 mL诱惑红、日落黄、胭脂红标准溶液及苋菜红、酸性橙Ⅱ标准储备液于样品中，制成加标西红花样品溶液。分别对阴性样品和加标样品进行检测，通过与标准溶液的表面增强拉曼光谱图中的特征峰比对可知，不同取样质量的西红花阴性样品中均未检出5 种酸性色素成分，而加标样品均可以检出酸性色素成分，表明样品取样质量不会对5 种酸性色素拉曼信号产生干扰。但试验发现，当取样质量不小于0.5 g时，5 mL提取溶剂无法将样品完全浸润，这是由于西红花实际为西红花的干燥柱头部位，质量较轻，0.5 g样品已占据离心管的2/3体积，加入提取溶剂无法将样品完全浸润。称取样品质量为0.05～0.2 g时，既可避免因取样量太大提取溶剂不能对样品完全浸润，造成提取效率低，又能避免取样量过大造成浪费。西红花染色目的一般为使样品颜色鲜艳、增加样品的重量，或者使用其它纤维用染料染色掺假，加入染料的量远远大于本方法的检出质量分数1 g/kg，所以选择取样质量为0.1 g。

2.2.2 提取溶剂优化

由于西红花自身存在的类胡萝卜素颜色鲜艳，且为水溶性色素，易干扰测定，导致检测结果不准确。分别选择水、30%(体积分数，下同)甲醇、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、90%甲醇溶液作为提取溶剂，考察不同提取溶剂对加标西红花样品溶液中色素提取及检测效果的影响。试验发现，当用水作为提取溶剂时，西红花本身色素的拉曼信号将其它成分拉曼信号覆盖，仪器无法对样品中已添加的5 种色素进行识别。这是由于西红花色素为水溶性色素，西红花色素在水溶液中溶出过多，其信号峰掩盖掉了色素的拉曼信号峰。当以30%甲醇溶液为提取溶剂时，仪器自动匹配结果出现样品中不存在的成分安妥，给结果判定造成干扰。当提取溶剂中甲醇的体积分数不小于50%时，5 种色素的拉曼信号均能被仪器识别，考虑到经济环保的因素，选择有机溶剂含量较少的50%甲醇溶液作为提取溶剂。

2.2.3 浓缩条件的选择

试验对浓缩条件进行了考察，取离心后的上清液氮吹至1 mL 左右，可使提取试剂中的甲醇挥发，以避免在后续检测中对色素拉曼峰的干扰。另外剩余1 mL左右液体可使色素保持在溶液中，避免其附着在试管壁上，造成复溶后不能完全溶解带来的损失，减少操作误差。

2.3 方法验证

2.3.1 检出限

取5 份0.1 g 西红花阴性样品，每份样品中各加入一种色素标准溶液或标准储备液(诱惑红、日落黄标准溶液的加入量和苋菜红标准储备液的加入量均为0.01 mL，胭脂红标准溶液的加入量为0.1 mL，酸性橙Ⅱ标准储备液的加入量为0.2 mL)，按照1.2.2方法处理后，5 份样品中诱惑红、日落黄、苋菜红的质量浓度均为0.5 μg/mL，胭脂红的质量浓度为5 μg/mL，酸性橙Ⅱ的质量浓度为10 μg/mL，样品通过SERS 法检测，均可检出相应色素的拉曼峰。当分别增大5 种色素的加入量时，仪器均显示检出相应的色素；而当分别减少5种色素的加入量时，仪器显示未检出色素成分。据此确定5种色素在样品基质溶液中的最低检出浓度分别为诱惑红0.5 μg/mL、日落黄0.5 μg/mL、苋菜红0.5 μg/mL、胭脂红5 μg/mL、酸性橙Ⅱ10 μg/mL，对应于样品中的最低检出质量浓度为诱惑红0.05 g/kg、日落黄0.05 g/kg、苋菜红0.05 g/kg、胭脂红0.5 g/kg、酸性橙Ⅱ1 g/kg。西红花染色目的一般为使样品颜色鲜艳、增加样品的重量，或者使用其它纤维用染料染色掺假，加入染料的量远远大于1 g/kg，本试验方法完全可以满足监管需求。

2.3.2 方法特异性

分别考察其它16 种易被非法添加的色素成分对该方法试验结果的干扰，将亮蓝、柠檬黄、丽春红s、酸性红、孟加拉玫瑰红、赤藓红、荧光桃红B、罗丹明B、碱性嫩黄O、碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ 16种色素标准品加入到阴性西红花样品中，制成加标样品溶液，用本试验方法对其进行处理及SERS检验，结果显示均为阴性，可知本试验方法特异性强，检测结果不易被干扰。

按照试验方法对诱惑红、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙Ⅱ 5种色素同时进行检测，通过调整5种色素的质量浓度，仪器可同时对诱惑红、苋菜红、胭脂红、酸性橙Ⅱ的拉曼光谱进行识别，而日落黄需要单标检测进行识别。但考虑到此方法为定性检测，只要样品检测过程中可以识别到含有非法添加的色素，即可判定样品为阳性，无须对所有色素进行同时识别。

2.4 实际样品的测定

采用建立的方法对30 批市售西红花样品进行检验，结果发现有3 批样品检出色素，见表3。经专属性更高的高效液相色谱-串联质谱法验证，与SERS 法结果一致。实验结果表明，该方法样品处理简单，检验速度快，检验结果准确，适用于西红花中非法添加诱惑红、日落黄、苋菜红、胭脂红和酸性橙Ⅱ5种酸性色素的快速检验。