辣椒油中罂粟碱标准样品的制备与定值

张信仁，张云，陈泽宇，刘正才

（1.三明海关综合技术服务中心，福建 三明 365000；2.福州海关技术中心，福州 350001）

标准样品是集科研与标准于一体的，具有均匀性、稳定性、准确性和溯源性的实物标准[1]。标准样品在测量系统校准、测量程序评估、给其它材料赋值和质量控制[2]、保证分析方法的准确性及可溯源性等方面具有重要作用[3]。标准物质分为纯品标准物质和基体标准物质[4]两类，标准样品可有效避免基体效应对物质成分分析的影响，能满足校准检测的实际需求，适用于食品分析方法的确认和质量控制，对于确保食品检验分析的准确性和有效性具有重要意义[5]。

罂粟壳为罂粟科植物罂粟采完鸦片后的干燥成熟果壳，具有一定的成瘾性，标志性成分为罂粟碱、那可丁、可待因、吗啡、蒂巴因等生物碱[6]，是国家严格控制的药用物质，严禁食品中非法添加，也是国家食品安全重点监查项目[7]。然而一些不法商贩为了谋取高额利益，将罂粟壳或其浸提物添加到食品中使消费者食用后容易上瘾，以达到吸引消费者的目的[8]，极大地危害人民群众的身体健康。因食品基体复杂多样，需要有对应的基质标准样品或质控样来检测校准，才能保证检测结果的准确性或满足要求[9]，由此可见基质标准物质对于检验检测至关重要，直接影响测量数据的准确性和可靠性，从而影响到此类案件的查处。虽然国家一级、二级标准物质已在国内外各领域得到广泛应用[10]，但是目前涉及的食品安全检测基体标准物质在非法添加物领域取得有证编号的仅有10个批号，5种物质[11]，未见食品基质中罂粟碱标准样品的相关研究报道。笔者以辣椒油为基质，加入一定量的盐酸罂粟碱标准品，研制了辣椒油中罂粟碱标准样品，该标准样品可用于火锅食品系列中罂粟碱检测的方法验证和质量控制。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：LC-30A 型，日本岛津公司。

三重四极杆质谱仪：AB3500 型，美国AB SCIEX公司。

冷冻台式高速离心机：Allegra 64R 型，美国Beckman Coulter公司。

超纯水机：Milli-Q Reference 型，美国密理博公司。

电子分析天平：XS204型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

脉动式多管涡旋振荡器：HMV-50A 型，天津市恒奥科技发展有限公司。

旋涡混合器：XW-80 A 型，上海精科实业有限公司。

盐酸罂粟碱标准品：纯度(质量分数)不小于99.9%，美国CATO标准品公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克公司。

无水乙酸钠、无水硫酸镁：分析纯，西陇科学股份公司。

1.2 标准样品制备

在辣椒油样品中加入一定浓度和比例的盐酸罂粟碱标准品，充分振荡混匀后，采用带密封盖的棕色玻璃瓶分装，并粘贴对应的标识，每瓶独立样品分装25 g左右。所制得的标准样品与实验室日常检测样品基本一致，于-18 ℃冰箱中存储，短期可常温下储存与使用。

1.3 测定方法

参考国家市场监管总局公告〔2018年第3号〕附件1 (BJS 201802)[12]，以液相色谱-串联质谱法测定，以色谱峰面积外标法定量，罂粟碱检测离子对质荷比为304.4/202.0(定量)，304.4/171.1(定性)。

1.4 样品均匀性检验

随机抽取15 份独立包装的样品进行均匀性检测，对抽取的每瓶样品，在重复条件下测定3 次，采用单因素方差分析(F检验)法对测定结果进行统计分析，以检验样品的均匀性。

1.5 样品稳定性检验

包含长期稳定性检验和短期稳定性检验，所用的人员、设备、方法及实验条件与均匀性检验相同。长期稳定性共进行了26个月，按照先密后疏的原则每间隔一定时间随机取样1次，每瓶样品重复检验3次，采用平均值作为检测结果进行统计分析；短期稳定性通过模拟运输条件，将稳定性测试结果的平均值与均匀性测定结果的平均值进行比较，采用F检验法评定样品的稳定性。

1.6 样品定值及不确定度分析

标准样品由9个通过资质认定的实验室协同定值，检测数据经正态分布检验[13‒14]、柯克伦(Cochran)检验及格拉布斯(Grubbs)检验[15]后取平均值进行定值。

参照国家标准GB/T 15000.3—2008[16]，通过建立有效的数学模型，对各种不确定度分量进行定量，利用相对标准不确定度进行分布计算和整体合成，通过推导计算，给出火锅食品(辣椒油)中罂粟碱含量的扩展不确定度。

2 结果与讨论

2.1 基质样品选择

为了使标准样品基质与实际检测样品接近一致，尽量消除基质干扰和基体效应引入的系统误差[17]，选择火锅食品底料中辣椒调味油阴性样品，经不锈钢滤网过滤，去除火锅残渣和辣椒籽后澄清辣椒调味油；也可选择市售的辣椒油或调和油，但是成分相对较单纯，与实际检测样品(成分较为复杂)基质会有偏差。

2.2 均匀性检验

在充分振荡混匀后的辣椒油标准样品分装前，随机选取上、中、下层的3 份样品进行均匀性初测，然后在已分装好的样品中随机抽取15 份独立包装样品，以每瓶样品3次重复测试数据为一组，共15组45 个数据，采用单因素方差分析法(F检验)检验样品的均匀性。计算F值，查F分布临界值Fa，若样品F＜Fa，则表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。均匀性检验方差分析结果见表1。结果表明，在95%的置信区间内，F＜F0.05，因此组间和组内不存在显著性差异，辣椒油中罂粟碱标准样品均匀性良好。

表1 辣椒油中罂粟碱标准样品均匀性检验方差分析结果

2.3 稳定性检验

2.3.1 短期稳定性

模拟样品运输极端条件进行短期稳定性检验，将独立包装的样品分别置于-18、4、25 ℃环境以及室外条件下保存14 d后测定；取独立包装样品分别邮寄至北京和深圳往返4～6 d，取样检测，每个样品重复测试3 次，考察其短期稳定性。对检测结果及均匀性数据同时采用F检验法，进行单因素方差分析，分析结果见表2。结果表明，当显著水平α=0.05时，样品F＜Fα(临界值)，其结果均未见显著差异，表明所研制的辣椒油基体标准样品短期是稳定的。

表2 辣椒油中罂粟碱标准样品短期稳定性方差分析结果

2.3.2 长期稳定性

进行了26 个月长期稳定性考察。按照先密后疏的原则，每间隔一定时间抽取独立包装的样品，每个样品重复测试3次。长期稳定性测定结果及F检验法检验、统计结果分别见表3和表4。采用F检验法检验一元线性回归模型的显著性(以Fs表述)，通过计算F来评估回归的显著性。对于95%的置信水平，罂粟碱的Fs≥0.05，表示回归不显著，表明所研制的标准样品在26 个月内是稳定的。目前该标准样品的稳定性实验仍在继续监控。

表3 辣椒油中罂粟碱标准样品长期稳定性检验测定结果

表4 辣椒油中罂粟碱标准样品长期稳定性回归统计分析结果

2.4 定值

2.4.1 定值实验室选择

标准样品采用多实验室协同定值的方案，参加协同定值的具有CMA(中国计量认证)资质的实验室有石家庄海关技术中心(编号001)、昆明海关技术中心(编号002)、厦门海关技术中心(编号003)、重庆海关技术中心(编号004)、福建中检华日有限公司(编号005)、福州海关技术中心(编号006)、天津海关动植物与食品检测中心(编号007)、三明海关综合技术服务中心(编号008)、南昌海关技术中心(编号009)。每个实验室测定3 个样品，每个样品平行测定2次，共计54个检测值。罂粟碱室外协同定值结果见表5。

表5 辣椒油中罂粟碱标准样品室外协同定值结果

2.4.2 离群值检验

为保证各实验室的检测值无异常值，依次采用正态分布检验的偏态系数和峰态系数法、柯克伦(Cochran)检验及格拉布斯(Grubbs)检验进行检验。

正态分布检验采用偏态系数和峰态系数法，置信概率P=0.95，测量次数n=54，经计算偏态系数A=0.136，峰态系数B=2.535，查表得A1=0.53，B1=2.15，B1′=3.99，则A＜A1，B1＜B＜B1′，表明该组测量数据服从正态分布。

柯克伦检验结果：当p=9，n=6时，查表得C0(5%)=0.328 5，计算C值为0.233 2，则C＜C0(5%)。

格拉布斯检验结果：当p=9 时，单值G1(5%，9)=2.215，G1(1%，9)=2.387，计算G11=2.206，G1p=2.311，则G11＜G1(5%，9)；双值G2(5%，9)=0.149 2，G2(1%，9)=0.085 1；计算G21和G2p值分别为0.840 3 和0.819 7，则G21＞G2(5%，9)，表明9家实验室对辣椒油基体中罂粟碱的检测数据符合正态分布，结果无异常值，均可参与后续检验，所有单元的数据均可参与定值。

2.4.3 定值结果

数据经正态分布检验、柯克伦检验及格拉布斯检验，所有单元的数据均可保留并参与最终定值，即协同定值实验室提供结果的平均值，结果为39.4 μg/kg。

2.5 溯源性

根据标准物质在空间上必须具有溯源量值的功能[18]。以有证标准物质配制的罂粟碱标准溶液制作校准曲线；测量前对所有计量仪器(分析天平、容量瓶、移液枪等)进行了校准，并考虑其示值不确定度；具有资质的9 家实验室协同定值，保证了结果的准确性和溯源性。

2.6 不确定度评定

定值结果的扩展不确定度UCRM参照GB/T 15000.3—2008 评定。由于标准样品采用邮政网络协同定值，因短期运输所引入的标准不确定度usts已包含在各实验室的检测值中，不用再单独计算。故标准品的不确定度来源由3 部分组成：定值标准不确定度uchar、瓶间标准不确定度ubb、长期稳定性标准不确定度ults。各项不确定度计算结果见表6。

表6 辣椒油中罂粟碱标准样品量值不确定度计算结果

在置信水平为95%时，k=2，将表6 数据代入下式计算扩展不确定度：

计算得UCRM=1.52 μg/kg。标准值由定值的总平均值与扩展不确定度组成，则辣椒油中罂粟碱标准样品的定值结果为(39.4±3.0) μg/kg.

3 结语

建立了火锅食品基质(辣椒油)中罂粟碱标准样品的制备方法。由9 家通过资质认证的实验室采用液相色谱-串联质谱法协作定值，量值可靠，均匀性和稳定性良好，罂粟碱特性值为(39.4±3.0)μg/kg。利用该方法制备的标准样品(质控样)对检测过程的质量控制、检测结果的准确性，对相关标准物质的研发、生产、制备以及确保食品安全均具有重要意义。