大黄鱼鱼卵磷脂与乳清分离蛋白复合分散液的制备工艺研究

林艺璇,陈宇涵,李 响,陈继承,梁 鹏

福建农林大学 食品科学学院,福建 福州 350002

大黄鱼是我国产量最大的海水养殖鱼类之一,根据2022年《中国渔业统计年鉴》[1],福建省大黄鱼产量约21.14万t,占全国总产量的83%,位居第一。虽然大黄鱼加工业迅速发展,但其加工副产物鱼卵仍未有效高值开发。课题组前期研究发现,大黄鱼鱼卵磷脂(Large yellow croaker roe phospholipid,LYCRPLs)富含ω-3多不饱和脂肪酸,如二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA),其中DHA和EPA含量高达41.90%,占总脂肪酸含量的15.19%[2]。磷脂是双亲性小分子表面活性剂,经常被用于降低乳液的界面张力,提高乳液稳定性[3]。而且与传统大豆磷脂和蛋黄磷脂相比,LYCRPLs具有更优异的乳化效果,是一种潜在的功能性乳化剂[4]。

乳清分离蛋白(Whey protein isolate,WPI)是从牛奶中提取的一种优质蛋白质,常用于乳制品、烘焙等产品,具有较好的乳化活性和乳化稳定性[5]。前期研究表明磷脂与蛋白之间存在相互作用,可以协同促进乳液稳定[6-8],如吴劲轩等[9]研究发现磷脂主要通过疏水相互作用与蛋白质相结合,从而改变蛋白构象,增强蛋白乳液的稳定性;Wang等[10]研究发现磷脂结构中不饱和脂肪酸含量越高,与蛋白之间的相互作用越强,制备的乳液稳定性也越好。目前,对磷脂-蛋白复合稳定性的研究多集中于大豆磷脂和蛋黄磷脂,关于LYCRPLs-WPI分散液的制备工艺尚未见报道。

作者以LYCRPLs和WPI为原料,以粒径和澄清指数为考察指标,在单因素试验的基础上,采用响应面法优化分散液的最佳制备工艺,以期利用LYCRPLs与WPI之间的相互作用,提高复合体系的稳定性,从而探讨LYCRPLs在乳制品中应用的可行性,为其深度开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大黄鱼鱼卵磷脂:实验室自制;乳清分离蛋白:上海麦克林生化科技股份有限公司;正己烷、95%乙醇、丙酮、叠氮钠、浓盐酸、氢氧化钠:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SQP电子分析天平:赛多利斯科学仪器有限公司;R-1001-VN旋转蒸发器:郑州长城科工贸有限公司;HN-3K手持均质机:上海汗诺仪器有限公司;Nano-ZS90马尔文激光粒度仪:英国Malvern公司;ST2100 pH计:奥豪斯仪器(常州)有限公司;LUMiFuge-111全自动稳定性分析仪:德国LUM公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大黄鱼鱼卵磷脂的提取

称取一定量的冻干大黄鱼鱼卵,按照鱼卵质量与乙醇体积1∶5(g/mL)加入95%乙醇,在室温下搅拌2 h后抽滤,所得滤液加入适量的正己烷进行提取,重复2次,将滤液旋蒸得到总脂质后溶解于冷丙酮中,放置过夜可得LYCRPLs沉淀物,即为试验用LYCRPLs样品,并置于-20 ℃备用。

1.3.2 单因素试验

以粒径和澄清指数为考察指标,分别研究pH(5、6、7、8、9)、均质时间(30、60、120、180、240 s)、均质速度(8 000、10 000、15 000、20 000、25 000 r/min)、WPI添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)以及LYCRPLs添加量(0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)对LYCRPLs-WPI分散液稳定性的影响。

1.3.3 LYCRPLs-WPI分散液的制备

25 ℃条件下使用磁力搅拌分别将LYCRPLs和WPI溶解在超纯水中,调节pH值。使用手持均质机均质后得到LYCRPLs-WPI分散液。将0.02%(g/mL)叠氮钠作为抑菌剂添加到分散液中,制备的待测样密封储存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.4 分散液粒径、PDI和Zeta电位的测定

将待测分散液样品用超纯水按照1∶50(V/V)稀释后放入激光粒度仪测量池中。水相和油相的折射率分别设定为1.333和1.460。

1.3.5 快速稳定性测定

吸取420 μL待测分散液样品于离心管中,通过全自动稳定性分析仪测定其稳定性。离心机通过连续记录样品透光率的动态变化来量化分散系统的稳定性。仪器操作条件:温度25 ℃,频率3 000 r/min,轮廓线30,时间5 min。

1.3.6 响应面试验

在单因素试验基础上,以分散液的粒径及澄清指数分别作为响应值Y1、Y2,选取对稳定性影响较大的3个因素,根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,设计三因素三水平的响应面优化试验。

1.3.7 分散液储藏稳定性测定

在最优工艺条件下制备LYCRPLs-WPI分散液,室温(25 ℃)储藏28 d。每7 d测定分散液的粒径、PDI及Zeta电位。

1.4 数据处理与分析

所有试验均平行测定3次,结果取平均值。采用SPSS 23、Origin 2018对数据进行处理,使用Design Expert 10进行响应面设计和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 pH值

pH值影响WPI和LYCRPLs之间的相互作用,导致分散液稳定性发生变化。如图1所示,随着分散液pH值的不断增大,分散液的粒径和澄清指数均呈现先降低后增加的趋势。pH 7时达到最低值,粒径和澄清指数分别为(249.5±1.67) nm和0.096±0.004。这可能是因为在偏离中性环境条件下,LYCRPLs的水解常数增大而发生水解,其囊泡结构被破坏,WPI暴露发生聚集,导致粒径增大;在靠近中性环境条件下,LYCRPLs先与WPI结合,避免了WPI之间的相互作用,从而防止因WPI聚集产生絮凝,导致分散液粒径和澄清指数增大[11-12]。研究证明,蛋白质分散液粒径的变化与蛋白聚集状态直接相关[13]。pH值越靠近中性,分散液粒径、澄清指数越小,稳定性良好。因此,选择制备分散液的最适pH值为7。

图1 pH值对分散液稳定性的影响

如图2所示,随着均质时间的增加,分散液的粒径与澄清指数逐渐降低,稳定性逐渐提高。可能是因为均质时间的延长使LYCRPLs和WPI充分结合,单一的LYCRPLs和WPI颗粒转化为LYCRPLs-WPI颗粒,从而提高分散液的稳定性[14]。当时间达180 s后,粒径和澄清指数变化较小,表明LYCRPLs和WPI已有效结合,分散液稳定性良好。均质时间延长会导致设备产生高温,影响分散液的稳定性,因此,选择制备分散液的最适均质时间为180 s。

图2 均质时间对分散液稳定性的影响

2.1.3 均质速度

如图3所示,均质速度对分散液粒径和澄清指数的影响与均质时间相似。随着均质速度的增大,分散液的粒径和澄清指数均逐渐减小。这是由于均质速度越大,产生的剪切力和作用强度越大,其均质效果越好,加快了LYCRPLs-WPI颗粒的形成,使分散液更稳定[15]。当均质速度达20 000 r/min后,粒径和澄清指数变化较小,因此,选择制备分散液的最适均质速度为20 000 r/min。

图3 均质速度对分散液稳定性的影响

2.1.4 WPI添加量

如图4所示,随着WPI逐渐增加,分散液粒径和澄清指数均逐渐减小。当WPI添加量达到1.0%后,粒径变化较小,而澄清指数略微增加。澄清指数与分散液的稳定性呈负相关,澄清指数越高表明体系越不稳定[16]。当LYCRPLs不足与WPI完全结合时,LYCRPLs-WPI颗粒和单一的WPI颗粒共同存在于分散液中。导致粒径虽然减小,但是澄清指数上升,分散液稳定性下降[17]。因此,选择制备分散液的最适WPI添加量为1.0%。

图4 WPI添加量对分散液稳定性的影响

2.1.5 LYCRPLs添加量

如由图5可知,随着LYCRPLs添加量的增加,分散液粒径逐渐增加,澄清指数逐渐减小。可能是因为更多的LYCRPLs和WPI结合,分散液中LYCRPLs-WPI颗粒的比例提高,导致粒径增大[10]。同时,LYCRPLs的双亲结构,在阻碍WPI之间聚集的同时,赋予分散液更多的亲水基团,可以提高分散液的稳定性[18]。因此,综合考虑,选择制备分散液的最适LYCRPLs添加量为0.50%。

在单元信息知识组织框架中，知识组织语义化过程表现在语义聚合层和数据关联层之中。从语义聚合到数据关联，包含了标识层、逻辑层和描述层。

图5 LYCRPLs添加量对分散液稳定性的影响

澄清指数即为不稳定性指数,能够综合判断分散液的稳定性,澄清指数越接近0,表示分散液越稳定[16]。粒径是指分散液中颗粒物大小,通常分散液中颗粒物粒径越小,稳定性越高[19]。因此,单因素试验以澄清指数为主要考察因素,粒径为次要考察因素。结果表明,影响分散液稳定性的因素由大到小为pH值、LYCRPLs添加量、WPI添加量、均质速度、均质时间。同时,在乳制品实际生产中,牛乳的pH值在7附近[20]。考虑到LYCRPLs-WPI复合分散液的实际应用,不将pH值作为响应面优化因素。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验基础上,以分散液的粒径及澄清指数分别作为响应值Y1、Y2,选取均质速度、WPI添加量、LYCRPLs添加量作为自变量A、B、C,进行响应面优化试验,设计方案及结果见表1。

表1 响应面试验设计方案及结果

利用Design Expert 10对表2进行分析,拟合得到二次多项回归方程:

表2 二次响应面回归模型方差分析

Y1=231.74-13.16A-12.52B+43.34C-2.25AB-1.27AC+8.56BC+2.22A2-8.15B2-9.78C2;

Y2=0.099-0.018A+0.008B-0.033C+0.005AB+0.006AC-0.018BC+0.017A2+0.054B2+0.014C2。

方差分析结果如表2所示,该模型的决定系数R12=0.990 1、R22=0.966 3,R2均接近1,表明实际值与预测值较为接近,该回归方程的拟合效果较好,能够较准确地预测响应值与自变量之间的关系。其中,A、B、C、BC均对粒径有极显著影响,C2、AC对粒径有显著影响;A、C对澄清指数有极显著影响,A2、C2、BC均对澄清指数有显著影响。由F可以看出3个因素对分散液稳定性的影响程度均为C>A>B。综上,该模型高度拟合,适用于优化分散液的制备工艺参数。

2.2.2 响应面交互作用分析

图6为均质速度、WPI添加量、LYCRPLs添加量的交互作用对响应值的影响。其中WPI添加量和LYCRPLs添加量之间的交互作用最强(图6(c)、(f)),均质速度和LYCRPLs添加量之间的交互作用次之(图6(b)、(e))。由图6(a)—(c)可知,随着均质速度的升高、WPI添加量增加、LYCRPLs添加量的减小,粒径逐渐减小。可能是因为分散液中WPI/LYCRPLs颗粒增多导致的结果[10]。由图6(d)—(f)可知,随着WPI添加量的降低、均质速度升高、LYCRPLs添加量的增加,澄清指数呈逐渐减小趋势。这可能是因为过多的WPI无法稳定在分散液中,导致分散液稳定性降低[21]。这一现象与单因素试验所得结果一致,也与表2中的方差分析结果相符。

2.2.3 验证试验

根据回归方程预测及响应面模型分析结果显示,当均质速度23 142.23 r/min、WPI添加量1.016%、LYCRPLs添加量0.632%,此时分散液理论粒径为244.7 nm,澄清指数为0.082。结合实际情况将各因素最佳工艺参数修正为均质速度23 000 r/min、WPI添加量1.0%、LYCRPLs添加量0.50%,经3次重复试验测得制备的分散液粒径为(215.20±2.12) nm,澄清指数为0.080±0.003,与理论结果相接近,说明该模型效果较好。

2.3 储藏稳定性分析

由表3可知,储藏初期(0 d)WPI-LYCRPLs分散液粒径较小,绝对电位值较大,分布较均匀。但从第21天开始,粒径和电位均发生变化,可能是因为随着储藏时间的延长,LYCRPLs的囊泡结构被破坏,导致WPI暴露聚集,使分散液粒径和电位均增大[22-24]。另外,PDI在储藏期间内无显著变化。结果表明,WPI-LYCRPLs分散液在25 ℃能够保持较长时间的稳定性。

3 结论

本研究以LYCRPLs为对象,在单因素试验的基础上进行响应面试验,优化了LYCRPLs-WPI分散液的制备工艺。最终确定制备分散液的最优工艺条件:均质速度23 000 r/min、WPI添加量1.0%、LYCRPLs添加量0.50%,制得的分散液粒径为(215.20±2.12)nm,澄清指数为0.080±0.003,与理论值较为接近,且稳定性良好。本试验未在牛奶中添加LYCRPLs进一步验证,课题组在后续试验中将进行LYCRPLs对牛奶品质影响的研究,加快推动LYCRPLs的深度开发。