植物甾醇负载的脂基纳米粒子的制备及表征

郭姝婧,汪学德,胡毓元,王 童,

河南工业大学 粮油食品学院,河南 郑州 450001

植物甾醇是存在于植物细胞膜中的一类天然甾体化合物,因其具有抗癌[1]、抗炎[2],特别是降胆固醇功效[3-5]而被人们广泛关注。研究表明,每天摄取1～3 g植物甾醇可降低人体血胆固醇10%左右,有效预防心血管疾病[6],但人们从日常膳食中获取的甾醇量很难达到这一标准。因此,将植物甾醇富集到功能强化食品中,是增加其摄入量并获得健康益处的有效策略。目前,对植物甾醇进行亲脂酯化是一种比较通用的方法,但这仅限于在高脂食品体系中递送甾醇[7]。近年来,也有研究尝试对植物甾醇进行亲水改性[8],但需要使用大量有机试剂,为食品安全带来隐患。胶体传输技术逐渐引起人们的关注,利用纳米级的载体递送甾醇不仅可以改善其水分散性差、结晶度高等问题,还可以提高植物甾醇在人体的生物可及性和利用度,是一种极具应用前景的技术[9]。

脂基纳米粒子是一种先进的胶体传输载体,由脂质核心(固体或固液混合)和表面活性剂外层组成,脂质核心有利于其对疏水性活性成分的封装,表面活性剂外层使其可以稳定地分散在水环境中,扩展疏水活性成分在食品体系中的应用范围[10-11]。此外,脂基纳米粒子还具有制备方法简易、适合大量生产、生物相容性好等特点,可作为植物甾醇的理想递送载体[12]。目前,关于利用脂基纳米粒子递送植物甾醇的研究十分有限,且多集中在传统的制备方法和非极性脂质配方等方面[13]。

脂基纳米粒子通常采用热高压均质技术制备[14],即先将溶解活性成分的热脂质相分散在含有表面活性剂的溶液中制成热乳液,再利用高压均质处理,最终冷却获取纳米级脂基粒子。然而高压均质能耗大,操作不够简洁,且样品处理量大时易造成堵塞。另外,鉴于甾醇分子结构上含有醇羟基,在传统的非极性脂质中溶解度偏低,采用甘油三酯基质不易获得高负载率的植物甾醇纳米粒子。因此,作者采用乳液模板法-超声联用制备负载植物甾醇的脂基纳米粒子,超声处理同样具有减小粒子尺寸的功能且便于操作,再加上空穴效应有利于对纳米粒子进一步修饰,可作为一种新型制备脂基纳米粒子的方法[15]。另外,选用具有一定两亲性的单硬脂酸甘油酯(GMS)作为脂质基质,可通过测试包封率研究该配方对植物甾醇负载效果,并对制备的纳米粒子进行微观结构表征及润湿性测试。脂基纳米粒子的开发为实现植物甾醇在水系功能食品体系中的高浓度递送带来了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物甾醇(总甾醇含量>95%,其中菜油甾醇24.82%、豆甾醇24.98%、β-谷甾醇43.28%):西安海斯夫生物科技有限公司;单硬脂酸甘油酯(95%)、大豆卵磷脂(>90%):上海麦克林生化有限公司;正己烷、无水乙醇、甲酸(色谱级)、无水甲醇(色谱级):天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax T10 basic高速剪切机:德国IKA公司;Scientz-ⅡD超声波细胞粉碎仪:宁波新芝生物科技股份有限公司;Zetasizer Nano S90分析仪:英国马尔文仪器有限公司;HT 7700透射电子显微镜:日本Hitachi公司;Agilent 1260高效液相色谱仪:美国安捷伦科技公司;BSA224S电子天平:北京赛多利斯科学仪器有限公司;GL-10000C离心机:上海安亭科学仪器厂;DK-FD10冷冻干燥机:山东博科科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 负载植物甾醇的脂基纳米粒子的制备

采用乳液模板法-超声联用制备负载植物甾醇的脂基纳米粒子。称取100 mg植物甾醇加入1 g GMS中,加热至85 ℃,磁力搅拌使固体物质全部溶解;含有0.8%表面活性剂(卵磷脂)的25 mL水溶液加热至85 ℃。将上述两相混合,用高速剪切机以24 000 r/min均质5 min,所得初乳液分别进行不同时间(2、4、6、8、10 min)和不同功率(0、60、120、180、240 W)的超声处理(间隔2 s开2 s),然后将纳米乳液分散在25 mL水中冷却,冷却方式选择急速和缓慢,最终制备一系列负载植物甾醇的脂基纳米粒子分散液。

表面活性剂的影响:选择0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%的表面活性剂,其他条件不变制备纳米粒子,测试对粒径、多分散指数(PDI)、Zeta电位和包封率的影响。

甾醇添加量的影响:选择添加100、150、200、250、500 mg的甾醇,其他条件不变制备纳米粒子,测试对粒径、PDI、Zeta电位和包封率的影响。

1.3.2 粒径、PDI、Zeta电位的测定

采用动态光散射(DLS)法测定样品的平均粒径、PDI、Zeta电位。为避免多次散射效应,每个原始样品用去离子水稀释50倍,并在测试前25 ℃保持3 min。

1.3.3 植物甾醇包封率的测定

参照文献[16]的方法并稍加改动,将4 mL分散液与3 mL正己烷混合,然后涡旋30 s,提取纳米粒中未被包封的植物甾醇。混合物以3 000 r/min离心3 min,收集上层有机相。重复上述操作2次以充分提取未被包封的甾醇。将所有收集的有机相合并,并氮吹干燥。所得干物质用1 mL无水乙醇复溶,过0.45 μm有机滤膜以进行高效液相色谱(HPLC)分析。

HPLC分析条件参照文献[17],用标样确定植物甾醇中各组分的保留时间,对所得植物甾醇的所有色谱峰积分,根据标准曲线确定植物甾醇含量。

包封率=(m1-m2)/m1×100%,其中,m1为样品中添加的总甾醇质量(mg),m2为未被包封的甾醇质量(mg)。

1.3.4 透射电子显微镜(TEM)观察微观结构

采用透射电子显微镜观察样品的形态学特征。在200目的铜网上滴约20 μL样品分散液,干燥后用磷钨酸染色,然后在100 kV的加速电压下进行观察。

1.3.5 静态接触角测试

使用光学接触角测量仪分别测定植物甾醇和负载植物甾醇的脂基纳米粒子(冻干后)的接触角。首先利用红外压片机将样品压成薄片,通过注射器在样品表面释放出一个水滴,然后使用仪器配备的分析软件测量水滴切面与样品平面的夹角。

1.4 数据处理

所有试验至少重复2次,数据用平均值±标准差表示。使用SPSS 24进行显著性分析,使用Origin 8.5制图。

2 结果与分析

2.1 纳米粒子的制备及条件优化

不同条件下制备的植物甾醇-脂基纳米粒子的粒径、PDI和Zeta电位如图1所示。由图1(a)可以看出,纳米粒子粒径随着超声时间的延长先减小后增加,其中4 min时的粒径最小,可能是因为超声时间过长导致纳米粒子之间又重新发生了聚集。图1(b)则显示超声可使粒子所带负电荷减少,可能是由于超声产生的空化效应使粒子的水化层减少,电位降低。斥力的减小逐渐造成部分粒子团聚,导致粒径增大,说明电位结果与粒径结果相一致。但总体来说,电位绝对值在30 mV以上时,粒子通常都可以通过静电排斥满足自身稳定性[18]。图1(c)显示4种超声功率下,粒径无明显差别,但都比无超声时明显降低,超声处理显然有助于获得粒径更小的纳米粒子。未经超声处理的样品粒径在180 nm以上,而经超声后获得的粒子粒径为120～140 nm,比文献[19-20]报道的用高压均质获得的脂质纳米粒子的粒径更小,说明利用超声处理制备脂基纳米粒子具有很好的应用和发展前景。值得注意的是,超声处理似乎更适合小批量的试验性研究,再加上超声产生的空穴效应有利于对纳米粒子进一步修饰,因此可作为研究和开发新型脂基纳米粒子的方法,与适合大批量生产的高压均质相互配合。由图1(d)可知,超声后纳米粒子带电量降低,与超声时间的结果相一致。图1(e)和(f)表明冷却方式也会对纳米粒子的粒径和电位产生影响,速冷的制备时间缩短,有效地阻止了纳米粒子聚集,更符合对负载植物甾醇的脂基纳米粒子的需求。另外,PDI结果显示所有制备的纳米粒子都具有良好的均一性,PDI在0.2以下说明此时的体系已经接近单分散体系,这与样品半透明甚至透明的外观结果一致。以上结果表明负载植物甾醇的脂基纳米粒子已成功制备。

2.2 表面活性剂

表面活性剂是构成脂基纳米粒子外层并将其稳定在水环境中的关键。表面活性剂含量对负载植物甾醇的脂基纳米粒子的影响如表1所示。磷脂含量增加有利于获得粒径小、均一度和包封率高的纳米粒子,而Zeta电位的差别不大。磷脂含量增加有利于其包覆在更多的油滴表层,在均质过程中得到更小的纳米乳滴,从而在冷却后得到粒径更小的纳米粒子。磷脂添加量大于0.8%,纳米粒子的结构逐渐趋于稳定,其包封率也都达到了99%以上。

表1 磷脂含量对纳米粒子粒径、PDI、Zeta电位、包封率的影响

2.3 甾醇添加量

为了研究以GMS为基质的脂基纳米粒子对植物甾醇的包封能力,制备了不同甾醇添加量的纳米粒子。由表2可知,随着甾醇添加量的增加,粒径也开始增大,说明更多的甾醇进入纳米粒子中(甚至有一些附着在粒子外层)。不过粒径在200 nm以内的分散液通常具有良好的物理稳定性以及半透明甚至透明外观等优点[21],加上PDI和Zeta电位并没有明显变化,可见甾醇添加量的增加对于纳米粒子结构的影响较小。从包封率来看,随着甾醇添加量的增加,虽然脂质基底对于甾醇的负载能力逐渐下降,但总体都大于90%,这已经是非常高效的封装。据报道,植物甾醇在水中的溶解度极差,仅为10-3～10-2mmol/L,即每毫升水中溶解植物甾醇的毫克数在10-4～10-3数量级[22]。根据本研究的甾醇添加量计算,以GMS为脂质基质的纳米粒子将植物甾醇在水中的浓度提高到了几毫克每毫升。GMS的两亲性或许是该纳米粒子优异性质及高负载率的重要原因,它可以对同样结构特点的植物甾醇表现出良好的相容性。此外,由于GMS有抑制植物甾醇结晶的作用,纳米粒子的形成更是使甾醇以无定型形式存在[23]。据报道,0.3 g无定型植物甾醇可降低胆固醇水平约37%[24],因此,GMS纳米载体有望实现在水系功能食品(如饮料)中添加植物甾醇并使其发挥令人满意的降胆固醇效果。

表2 甾醇添加量对纳米粒子粒径、PDI、Zeta电位、包封率的影响

2.4 植物甾醇-脂基纳米粒子的微观形貌

用TEM观察样品的微观形态,如图2所示,负载植物甾醇的脂基纳米粒子呈均匀分散的球形,粒径为100～200 nm,与DLS测试结果一致。图2(b)显示纳米粒子外有一层亮圈包围,这可能是磷脂乳化剂层。

注:磷脂0.8%、甾醇添加量100 mg。图3同。

2.5 植物甾醇-脂基纳米粒子的水分散性

图3(a)显示样品很好地分散在水中,在质量浓度为10 mg/mL时,分散液仍然呈半透明。而天然植物甾醇加入水中只能浮在水面上,即使超声处理后仍然没有明显变化。由图3(b)看出植物甾醇表现出明显的疏水性,而纳米粒子的接触角为81.8°(<90°),说明其在水中润湿性较好,能够很好地分散。良好的水分散性表明负载植物甾醇的脂基纳米粒子也可以作为固体冲剂添加到食品体系中,有利于样品的储藏。

注:(a)复溶后照片;(b)接触角。植物甾醇为对照。

3 结论

单硬脂酸甘油酯对于植物甾醇具有很好的相容性,以其作为脂质基质可以制备高负载率(甾醇添加量100～500 mg时包封率均大于90%)的植物甾醇-脂基纳米粒子。适当的超声(时间4 min,功率120 W)有助于获取粒径更小的纳米粒子,使纳米粒子分散液呈半透明甚至透明的状态。TEM照片显示纳米粒子外层由磷脂乳化剂稳定,因此可以更好地分散在水环境中。此外,脂基纳米载体增加了植物甾醇在水中的润湿性,使样品在冻干后仍然具有较好的水分散性。然而,要想实现植物甾醇-脂基纳米粒子在水系功能食品中的应用,仍有许多问题需要深入探究,比如纳米粒子的稳定性,脂质基质对植物甾醇释放及生物可及性的影响。