小鼠原始卵泡形成过程中可变剪切的动态变化

孙文亚，何元林，陈秋臻，李 晶

南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166

在哺乳动物中，固定数量的原始卵泡是整个生殖寿命期间可受精的卵母细胞的来源。随着青春期后卵泡的持续周期性发育，原始卵泡储备减少，直至最终耗尽，出现一系列生理变化，如绝经［1］。人类绝经的平均年龄为51岁（40～60岁）；然而，全球仍有1%～2%的女性患有早发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI），女性在40 岁以前出现卵巢功能减退，主要表现为月经异常、促卵泡激素水平升高、雌激素波动性下降，继而导致生育力下降、不孕［2］。POI 的病因复杂，有研究表明其与原始卵泡早期耗竭有关［3］。因此，原始卵泡池的建立即原始卵泡组装过程是雌性生殖研究领域的重要课题之一。

小鼠卵泡组装过程开始于胚胎期第17.5 天（embryonic day 17.5，E17.5），并在出生后的前3 d内完成，在最初卵泡形成的时候，卵巢的整体组织结构发生了巨大的变化，细胞增殖分裂活动十分活跃［4］。卵泡组装的不同步决定了生殖细胞的异质性，3 种生殖细胞（包囊中的生殖细胞、经过包囊破裂的生殖细胞和卵泡中的生殖细胞）在新生雌鼠（postnatal day 0.5，P0.5）卵巢中同时存在［5］。理论上，这些生殖细胞中转录组的变化可以准确地代表卵泡形成过程中的发育阶段转变。本实验前期通过对P0.5 卵巢中收集的146 个单个生殖细胞的转录组进行测序，重建了卵泡组装过程中生殖细胞随时间的动态变化，构建了生殖细胞从包囊（E17.5）到包囊破裂（P0.5）再到卵泡形成（P2.5）的单向伪时间发育轨迹，并构建了细胞发育阶段相关的转录因子调控网络［6］。

可变剪切，也叫选择性剪切，是指在mRNA 前体到成熟mRNA 的过程中，不同剪切方式使得同一个基因可以产生多个不同的成熟mRNA，最终产生不同的蛋白质。可变剪切导致了转录本和蛋白质结构及功能的多态性，基因表达调控在适应性分化和进化中起着核心作用，调控高度多样化的过程如细胞分化［7］，但大多数研究只探索了转录本水平的进化，而忽略了转录本结构的潜在重要作用［8］。作为一种关键的基因表达调控机制［9］，该过程在细胞分化和谱系确定、组织特性获取和维护以及器官发育方面发挥作用，转录-剪切耦合调控已在雄性生殖细胞发育中得到证明［10］。有丝分裂精原细胞向减数分裂精母细胞转变的过程中存在广泛的剪切转录本［11］。据报道，小鼠和人类MⅡ期卵母细胞中存在保守的阶段特异性转录变体［12］。成熟生发泡卵母细胞中Srsf3 的条件性缺失导致生发泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）缺陷，其原因是可变剪切异常和B2 正弦转座因子受到抑制［13］。这一结果显示了可变剪切调控母体转录组的建立。然而，迄今为止，关于卵母细胞发育过程中可变剪切事件动态调控的研究还很少。

本研究通过对单个生殖细胞的转录组数据进一步分析，揭示了卵泡组装过程中富集的可变剪切事件以及差异可变剪切（differential alternative splicing，DAS）对卵母细胞命运的调控，卵泡形成时可变剪切事件最为活跃，包囊破裂到卵泡形成转换时DAS事件最为富集，这为卵细胞转录本多样性或蛋白质多样性提供了支持。这些DAS 基因在卵母细胞发育各个阶段的动态差异表达也表明它们有着调节卵母细胞发育分化进程的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

成年C57BL/6 雌性孕鼠来自北京Vital River 实验室，饲养于南京医科大学实验动物中心。所有动物实验方案均经南京医科大学动物实验伦理委员会批准。小鼠在22 ℃12 h/12 h 的明暗循环条件下饲养，并提供充足的食物和水。微量总RNA 提取试剂盒（RNAprep Pure Micro Kit，DP420，北京天根生化科技有限公司），PCR 引物由南京擎科生物技术有限公司合成，PCRmix（PN 176-5211，Bio-Rad Laboratories，美国），逆转录酶（南京诺维赞公司），ABI StepOnePlus（赛默飞，美国），高通量荧光定量PCR 仪（Fluidigm，美国），显微镜（SMZ1000，尼康）。

1.2 方法

1.2.1 可变剪切与DAS事件的识别

数据来源于本实验室前期从初生小鼠卵巢中收集的146 个单个生殖细胞转录组测序结果，NCBI GEO（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库编号为GSE152407。

7 种可变剪切事件包括跳跃外显子（skipping exon，SE）、可变的5＇和3＇剪切位点（alternative 5＇splice site，A5/alternative 3＇splice site，A3）、保留内含子（retained intron，RI）、互斥外显子（mutually exclusive exon，ME）以及可变的第一个外显子（alternative first exon，AF）和可变的最后一个外显子（alternative last exon，AL），由SUPPA2［14］（v2.2.1）识别，并使用GENCODE（vM20）注释作为参考。对于每个可变剪切事件，至少有一半的细胞有PSI（percentage or proportion spliced-in）值才认为可变剪切事件存在于这个细胞簇中。然后，应用SUPPA2来识别相邻细胞发育阶段中都存在且P＜0.01 的DAS 事件。最后，使用ggsashimi［15］绘制桑基图对多个样本的剪切事件进行可视化。

1.2.2 实时定量PCR

分别收集E17.5、P0.5、P2.5 母鼠，在Hanks 平衡盐溶液中小心地取出卵巢，按照说明书使用RNAprep Pure Micro Kit 试剂盒分离总RNA。逆转录后，使用SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX在ABI StepOnePlus 平台上进行基于Eva green 的RT-PCR。以肌动蛋白扩增信号为内控，采用2-ΔΔCT方法量化各种mRNA。用熔解曲线分析评价PCR产物的特异性。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.2.3 聚合酶链式反应（PCR）

为了测定同源异构体的分子量和相对表达量，我们收集了E17.5、P0.5、P2.5 母鼠卵巢，提取总RNA，逆转录后，使用Green Taq mix（Vazyme）进行Touchdown PCR扩增，严格按照说明书操作，使用引物详见表2。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中以120 V电泳30 min，使用Tanon 1600曝光检测DNA的表达，使用Image J对荧光强度进行分析，实验重复3次。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequences of PCR

1.3 统计学方法

所有测量均独立进行，至少重复3次。实时RT-PCR数据用均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析评价组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵泡组装过程中可变剪切事件

为了探究卵泡组装过程中可变剪切事件随着细胞发育的变化，分析了卵泡组装过程生殖细胞从包囊、包囊破裂到卵泡形成3个阶段（图1A）的可变剪切事件。7 种可变剪切事件类型在3 个发育阶段均被识别，其中SE 类型可变剪切事件最为富集，AF 其次（图1B），3个发育阶段细胞的可变剪切事件有较多重合，但仍存在差异（图1C）。每个发育阶段各类型可变剪切事件数目呈动态变化，卵泡形成时期各类型可变剪切事件最多，包囊时期其次，包囊破裂时期最少，这表明在卵泡组装的进程中，卵泡形成时期可变剪切的调控最为活跃。即通过可变剪切产生的mRNA 和蛋白质亚型最多，从而调控功能性卵细胞的形成。

图1 卵泡组装过程中可变剪切事件Figure 1 Alternative splicing events during follicle assembly

2.2 卵泡组装过程中剪切因子变化

使用SUPPA2研究单细胞水平不同阶段之间转换时可变剪切的具体变化。小提琴图展示了剪切因子在3个发育阶段表达的动态变化（图2A），其中Alyref、Ccdc12 的表达随着细胞发育呈上升趋势，在卵泡形成时表达最高，表明这两个剪切因子在功能性卵泡形成时可能发挥重要作用，接下来用RT-PCR 验证这几个剪切因子在E17.5、P0.5 和P2.5小鼠卵巢中表达量的变化（图2B）。

图2 卵泡组装过程中可变剪切因子的表达Figure 2 Expression of splicing factors during follicle assembly

2.3 卵泡组装过程中DAS事件

在从包囊到包囊破裂和从包囊破裂到卵泡形成的阶段转换中分别识别出893 和2 529 个DAS 事件（P＜0.01），包囊破裂到卵泡形成中的DAS 事件增多，再一次表明卵泡形成时可变剪切事件的活跃。此外，细胞发育阶段转换之间的DAS事件类型表现出高度的特异性（表3）。在分析DAS事件的类型时，发现SE 和AF 是最丰富的剪切形式。与以往对其他细胞类型的研究不同，本研究结果显示卵母细胞中AF 类型的可变剪切的比例极高，特别是从包囊破裂过渡到卵泡形成时，共发现676 例（26.7%）AF可变剪切事件。卵泡组装过程中细胞发育阶段间的DAS 事件再一次表明随着生殖细胞发育进程，可变剪切事件发生了剧烈变化以支持卵细胞形成时功能性蛋白编码基因的多样性。

表3 卵泡组装过程7种差异可变剪切事件数目及占比Table 3 The numbers and percentages of seven types of differential alternative splicing events during follicle assembly ［n（%）］

2.4 卵泡组装过程中可变剪切基因的动态调控

桑基图显示了卵母细胞从包囊到包囊破裂、包囊破裂到卵泡形成之间转换时DAS 事件的动态变化，可见相比包囊到包囊破裂过渡阶段，包囊破裂到卵泡形成过渡阶段的可变剪切发生了剧烈变化（图3A）。GO分析揭示从包囊到包囊破裂DAS基因富集在细胞周期，从包囊破裂到卵泡期的DAS 基因富集在RNA 剪切、翻译、DNA 修复过程和减数分裂细胞周期等生物学过程（图3B）。剪切调控中可变剪切基因，如异质核糖核蛋白（HRNP）家族基因的富集，表明卵泡组装过程中剪切机制的不同调节［16］。SE 和AF 类型的可变剪切基因Sycp1和Hormad1参与了第一次减数分裂前期突触复合体的形成［17-18］，它们在卵泡中的表达显著降低，PCR实验结果表明它们在卵泡发育后期转录本外显子包含水平呈显著降低趋势（图4），这与卵母细胞减数分裂在二倍体期阻滞直至排卵相一致，表明可变剪切基因可能有着抑制减数分裂的作用。另一个确定的可变剪切基因Kdm1a 编码一种组蛋白去甲基化酶，它能使组蛋白H3第4赖氨酸和组蛋白H3第9赖氨酸去甲基化，PCR 实验显示它的同源异构体在不同发育阶段的卵细胞中也是动态变化的，这个结果和Kdm1a调节神经发育结果类似［20］，表明Kdm1a的同源异构体同时参与卵泡生成的调控。我们还检测了其他几个可变剪切基因，包括SE 类型的Gtsf1、Eif4a2，AF类型的Ncl的动态变化。Gtsf1是一种基本的配子发生因子，在哺乳动物中高度保守，参与维持配子发生过程中的遗传稳定性，PCR 实验显示它在卵泡中的表达显著上升，可能在卵泡发育过程中发挥重要作用［21］；Eif4a2 是一种真核细胞翻译起始因子，在卵巢中有较高的表达；Ncl是一种核仁蛋白编码基因，两种AF 类型的同源异构体呈现不同的表达模式，可能也暗示着对卵泡发育不同的调控模式。因此，我们发现了以前未被识别的卵母细胞可变剪切事件以及参与调控卵泡组装中可变剪切基因的动态表达。

图3 卵泡组装过程可变剪切基因动态变化及功能富集Figure 3 Dynamic changes and functional enrichment of alternative splicing genes during follicle assembly

图4 代表性差异可变剪切基因的可视化及PCR验证Figure 4 Sashimiplots and PCR validation of representative differential alternative splicing genes

3 讨论

哺乳动物原始卵泡的组装是卵巢生殖生物学中最关键的过程之一，它直接影响雌性在整个生殖过程中可用的卵母细胞的储备，决定了生殖寿命。

可变剪切是一种普遍存在的基因表达调节机制，通过该机制，单个基因可以器官、组织或细胞类型特异性的方式产生一个以上独特的mRNA 种类［9］。可变剪切是多细胞真核生物转录组高度复杂的重要原因，丰富了蛋白质和表型性状的多样性［22］。小鼠基因组中的绝大多数（89%）蛋白质编码基因都经历了可变剪切［13］。目前对大量细胞RNA-seq 数据的可变剪切研究较多，只有较少的研究集中在单细胞水平上。

本研究在卵泡组装过程的细胞发育阶段转换之间检测到广泛的可变剪切事件，尤其是卵泡期检测到了最多的可变剪切事件，其中包囊到包囊破裂和包囊破裂到卵泡期分别富集了893 和2 529 个DAS事件。这表明卵泡期的可变剪切较为活跃，为卵泡的功能性基因表达或蛋白多样性提供了支持。本研究数据也显示了可变剪切基因沿着发育轨迹的动态表达模式。这表明单细胞亚型多样性影响蛋白的编码谱，进而影响卵泡形成过程中的细胞分化。

本研究富集了大量与减数分裂调控有关的可变剪切事件，并验证了减数分裂相关基因亚型的存在，比如SE类型的Sycp1和Hormad1，并发现了它们在阶段转换时可变异构体的变化。在卵泡形成过程中，减数分裂或精子发生相关基因表达的显著降低与卵母细胞减数分裂在二倍体期阻滞直至排卵相一致。此外，该分析还有助于鉴定可能在卵母细胞发育中起作用的基因的功能亚型或蛋白质。这些可变剪切相关的基因亚型或蛋白是否在卵母细胞中发挥不可缺少的作用还需进一步的探究。除了SE 类型剪切，本研究也揭示了AF 剪切类型的富集，尤其是在包囊破裂到卵泡形成转换期间。总之，本研究结果揭示了可变剪切在卵泡组装过程中和细胞阶段转换相关，具有促进细胞分化、抑制减数分裂等作用，揭示了卵泡组装过程中转录-可变剪切偶联调控的重要性。