脑膜淋巴管转运功能障碍加重脂多糖诱导的小鼠中枢炎症

谢 雯，董洪权，侍崇龙，金文杰

南京医科大学第一附属医院麻醉科，江苏 南京 210029

固有免疫激活是神经系统疾病病理过程的重要组成部分。中枢神经系统（central nervous system，CNS）的稳态与固有免疫的平衡息息相关［1］。失调的CNS固有免疫参与多种CNS疾病的发生和发展。研究CNS与固有免疫之间的关系，有助于更好地了解神经系统疾病的发病机制，制定有效的治疗策略。

小胶质细胞（microglia，MG）是大脑固有免疫系统的主要细胞成分，受到压力、脑外伤、感染等刺激时被激活并向受损细胞游走迁徙，吞噬死去的细胞［2］。大脑受损时，损伤相关分子模式（damagerelated molecular pattern，DAMP）和病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）等作用于MG，产生活性氧、补体和促炎细胞因子，如白介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等，导致大脑功能进一步受损［3］。MG 的活化和促炎细胞因子的释放在中枢炎症中发挥核心作用。适当的中枢炎症可以促进细胞碎片的清除和组织修复，恢复神经元稳态并保护神经元的完整性［4］。过度且持续的中枢炎症活化MG，促炎细胞因子大量释放，激活MG 的神经毒性作用［5］。大量证据表明，中枢炎症是CNS 疾病中最常见的病理之一［6-8］。因此，调控中枢炎症对于治疗CNS疾病具有重要的意义。

近几年的研究表明，脑膜淋巴管（meningeal lymphatic vessel，mLV）参与大脑中大分子毒性介质、免疫细胞、细胞碎片等物质的清除和引流［9-10］。Absinta 等［11］通过体内磁共振成像的技术证实人类mLV 的存在。mLV存在于硬脑膜中，表达淋巴管内皮细胞的特异性标志物：血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR3）和淋巴管内皮细胞透明质酸受体1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1，LYVE-1），受到血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）/VEGFR3 信号的持续调控［10］。它能够将外周免疫细胞、细胞因子、大分子蛋白和CNS 衍生的抗原从脑膜间质和脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中引流至颈深淋巴结（deep cervical lymph node，dCLN），随后进入外周器官代谢清除。脑膜淋巴系统对于清除大脑中的β-淀粉样蛋白（amyloid β，Aβ）、细胞外tau蛋白和α-突触核蛋白至关重要［12-14］。mLV 转运功能损害可导致神经毒性物质的积累，导致认知功能障碍。然而，mLV转运功能在中枢炎症中的作用仍然知之甚少。

VEGFR3是一种酪氨酸激酶受体，它与VEGF-C结合可诱导淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，从而促进淋巴管生成。MAZ51 是VEGFR3 选择性抑制剂，能够抑制mLV 生成［15］。本研究通过腹腔注射LPS建立小鼠中枢炎症模型［16-17］，观察中枢炎症对mLV的影响，使用VEGFR3 抑制剂MAZ51 抑制mLV 生成，阐明mLV 功能障碍对中枢炎症的影响，为临床治疗CNS疾病提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

采用成年雄性SPF 级C57BL/6 小鼠（6～8 周龄）建立模型。实验小鼠购于维通利华，放置在标准实验室条件中饲养［（25±2）℃，12 h昼夜循环光照］，自由饮水摄食。小鼠适应性饲养1周后进行实验。所有动物实验均经南京医科大学实验动物使用与管理委员会批准（批准号：IACUC-2008037）。

1.1.2 主要试剂与仪器

小鼠IL-6、IL-1β Quantikine ELISA 检测试剂盒（R&D 公司，美国）；LPS 来自大肠杆菌0111：B4（Sigma Aldrich 公司，美国）；Iba-1 抗体（Wako 公司，日本）；LYVE-1 抗体（Abcam 公司，美国）；OVA-647（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；RIPA 缓冲液（上海碧云天公司）；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（Roche公司，瑞士）；DAPI染液（Abcam公司，美国）；脑立体定位仪（深圳瑞沃德公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药方法

首先将16 只C57BL/6 小鼠随机分为4 组，LPS组12 只，分别腹腔注射LPS（2 mg/kg），12、24、72 h后各取4只进行实验。Control 组4只给予相同体积的生理盐水腹腔注射，作为对照。

其次将8 只小鼠随机分为2 组，分别为Control组和MAZ51 组，将MAZ51 溶解于二甲亚砜中，以10 mg/kg腹腔注射，持续30 d，每周5 d，共6周，对照组给予相同体积的二甲亚砜［15］。42 d后枕大池注射荧光标记蛋白OVA-647（3 μL），1 h 后处死小鼠，取dCLN、硬脑膜进行分析。

另取24 只小鼠随机分为Control 组、MAZ51 组、LPS组、LPS+MAZ51组，每组6只。用相同的方法腹腔注射MAZ51，42 d后将小鼠放入行为学仪器中进行训练，30 min后对LPS组和LPS+MAZ51组腹腔注射LPS，其余两组注射相同体积的生理盐水。1 d后进行行为学实验，实验结束后处死小鼠，取海马进行分析。

1.2.2 脑枕大池立体定位注射

腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉小鼠，颈部皮肤剃毛消毒后放入脑立体定位仪中并三角固定。切开皮肤，暴露枕大池，用Hamilton微量注射器吸取OVA-647（3 μL）以2 μL/min 的速率注入枕大池中。注射后，将注射器停留在原处2 min，以免CSF回流，然后缝合颈部皮肤，让小鼠在加热垫上恢复至完全清醒。

1.2.3 免疫荧光染色

麻醉小鼠后剪开颈部皮肤，向下牵拉胸锁乳突肌，暴露dCLN 并用镊子取出，放入4%多聚甲醛中固定24 h，用20%和30%的蔗糖梯度脱水后连续冰冻切片（厚度10 μm），用PBS 洗去残余OCT 包埋胶后DAPI 封片。取完dCLN 后用生理盐水和4%多聚甲醛灌注心脏，剪去颈部肌肉，剥出头盖骨，放入4%多聚甲醛中固定24 h，PBS 洗涤1 遍，在显微镜下用镊子剥出硬脑膜，贴在载玻片上，烘干。

LYVE-1 染色：脑膜用PBS 洗涤后，在室温下用含2 g/L Triton X-100牛血清白蛋白孵育1 h，加入带有红色荧光基团的兔抗-LYVE-1（1∶200），在4 ℃冰箱中孵育过夜，次日用PBS洗涤（5 min×3次）后，用DAPI封片。

封片后使用Thunder Imager 快速高分辨倒置荧光成像系统（LEICA 公司，德国）扫描拍照。计算mLV内皮细胞标志物LYVE-1荧光面积以及淋巴结内OVA-647荧光占整个淋巴结面积的百分比。

1.2.4 免疫组织化学染色

用戊巴比妥钠麻醉小鼠后，用生理盐水和4%多聚甲醛进行灌注，取出大脑，用4%多聚甲醛固定24 h，蔗糖溶液梯度脱水，待沉底后用OCT 胶包埋脑组织，固定后连续切片（厚度10 μm），选出海马切片，用PBS 清洗后在常温下放入3%H2O2中浸泡10 min，洗涤后用5% BSA 封闭液中封闭1 h，加入用1% BSA 稀释后的一抗（1∶200），在4 ℃冰箱中过夜，次日用PBS 洗涤3 次后加入相应的二抗，孵育1 h 后PBS 洗涤3 次，用DAPI 封片。选取海马CA1 和CA3 区拍照。细胞计数应用NIH Image J 软件。

1.2.5 ELISA

使用小鼠IL-6、IL-1β Quantikine ELISA 试剂盒测量小鼠海马组织匀浆中细胞因子IL-6、IL-1β水平。具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 逃避恐惧实验

逃避恐惧实验用来评估小鼠的海马依赖性记忆。训练小鼠将无条件刺激（足部电击）和条件刺激（音调）与环境联系起来。先进行训练，将小鼠放入TFC 仪器中自由探索100 s，然后给予小鼠听觉刺激20 s（80 db，5 kHz），后立即给予足底电击（0.8 mA），重复2 次，中间间隔100 s。刺激结束后30 min 腹腔注射LPS，1 d后评估小鼠学习恐惧的情景记忆，通过视频跟踪软件（Xeye Fcs，北京天鸣鸿远科技发展有限公司）自动记录小鼠300 s内除呼吸以外没有任何运动的僵直反应时间。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析和t检验确定差异显著性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS腹腔注射对mLV转运功能的影响

小鼠腹腔注射LPS，12、24、72 h 后于枕大池中注射OVA-647（3 μL），取脑膜和dCLN 进行分析，如图1 所示，与Control 组相比，LPS 组小鼠脑膜中mLV 标志物LYVE-1 面积、dCLN 的OVA-647 荧光面积明显减少，差异具有统计学意义，其中24 h 时达到最低，72 h 时面积有所回升，仍低于基础水平。取小鼠海马分析MG 活化情况和炎症因子水平，MG 活化标志物Iba-1、炎症因子IL-6、IL-1β水平在24 h 达到最高（P＜0.01，图2），72 h 回落，说明LPS 导致mLV 转运功能下降，并随着时间有所恢复。

图1 LPS处理对小鼠脑膜淋巴管转运功能的影响Figure 1 Effects of LPS treatment on the transport function of meningeal lymphatic vessels

图2 LPS处理对海马小胶质细胞活化和炎症因子的影响Figure 2 Effects of LPS treatment on microglia activation and inflammatory factors in the hippocampus

2.2 VEGFR3抑制剂可影响mLV转运功能

小鼠腹腔注射VEGFR3 抑制剂MAZ51，42 d后检测mLV 的转运功能。如图3 所示，与Control组相比，MAZ51 组的mLV 内皮细胞标志物LYVE-1荧光面积显著减少，OVA-647面积减少，提示VEGFR3抑制剂通过抑制mLV 的生成来降低mLV 的转运功能。

图3 MAZ51对脑膜淋巴管转运功能的影响Figure 3 Effects of MAZ51 on the transport function of meningeal lymphatic vessels

2.3 VEGFR3抑制剂促进LPS诱导的MG激活

小鼠腹腔注射MAZ51 后，腹腔注射LPS，检测海马MG 的活化情况。如图4 所示，MAZ51 组的海马CA1、CA3 区Iba-1 表达量与Control 组相比无差异。LPS 组Iba-1 表达相比Control 组大幅提高，而LPS+MAZ51 组Iba-1 表达相比LPS 组则进一步升高，提示预先注射MAZ51 导致淋巴功能下降会进一步增加LPS 引起的MG 活化。

图4 MAZ51对小胶质细胞活化的影响Figure 4 Effects of MAZ51 on the activation of microglia

2.4 VEGFR3抑制剂可影响炎症因子的释放

通过ELISA 测定小鼠海马区IL-6 和IL-1β的含量。结果如图5 所示，LPS 和LPS+MZA51 组海马区炎症因子表达增加；与LPS 组相比，LPS+MAZ51 组炎症因子表达显著增加。以上结果说明LPS促进海马炎症因子的释放，VEGFR3抑制剂加剧这一过程。

图5 MAZ51对小鼠海马区炎症因子表达的影响Figure 5 Effects of MAZ51 on expression of inflammatory cytokines in the hippocampus of mice

2.5 VEGFR3抑制剂可以加重LPS诱导的小鼠恐惧记忆损伤

许多疾病和状态都会出现mLV的损伤，伴随认知功能障碍，如阿尔兹海默症和衰老［18］，为此，本研究进行逃避恐惧实验评估小鼠的认知功能。如图6所示，MAZ51组小鼠并未出现恐惧记忆损伤，LPS组则出现明显的恐惧记忆损伤，僵直时间减少，LPS+MAZ51 组小鼠僵直时间相比LPS 组显著缩短，说明MAZ51 导致的淋巴管转运功能下降加重LPS 对认知功能的损伤。

图6 MAZ51加重LPS诱导的小鼠恐惧记忆损伤Figure 6 MAZ51 exacerbates LPS-induced fear memory impairment in mice

3 讨论

本研究探讨了mLV 转运功能障碍对LPS 诱导的小鼠中枢炎症的影响。研究发现小鼠中枢炎症模型建立后脑膜LYVE-1 以及dCLN 中OVA-647 的荧光面积明显减少，mLV 转运功能显著降低，1 d达到高峰，可至少持续3 d；同时伴有炎症因子IL-6、IL-1β的水平增加，MG 活化标志物Iba-1 表达增加。VEGFR3 抑制剂MAZ51 导致的mLV 转运功能障碍可进一步升高海马中炎症因子IL-6、IL-1β的水平，促进MG活化，加重小鼠认知功能损伤。

CNS 疾病是全世界死亡和残疾的主要原因。2016年全球疾病负担、伤害和风险因素研究分析发现CNS 疾病是2016 年全球第二大死因［19］。中枢炎症是改善CNS 疾病导致的认知功能损伤的重要靶点［20］。研究表明，创伤性脑损伤前存在mLV功能障碍会导致与神经炎症和补体信号相关的基因在损伤后24 h表达升高［15］；对肝性脑病小鼠应用VEGF-C增强mLV功能可以降低促炎因子的表达［21］。因此，本研究探讨mLV 功能障碍对中枢炎症的影响。首先，本研究通过对小鼠腹腔注射LPS 成功建立中枢炎症模型，并发现中枢炎症可以影响mLV转运清除功能，导致认知功能障碍。

为进一步研究的mLV 功能障碍对中枢炎症的影响，本研究使用腹腔注射VEGFR3 受体拮抗剂MAZ51，抑制mLV 的转运功能，检测小鼠海马中IL-6 和IL-β的水平，以及MG 活化情况。结果显示MAZ51 组mLV 标志物LYVE-1 荧光面积相对于Control组显著减少，但海马炎症介质水平、MG活化水平以及小鼠行为学均无明显变化，提示年轻小鼠mLV清除大分子毒性物质的功能由血脑屏障、自噬等途径代偿。中枢炎症会破坏血脑屏障，导致线粒体功能障碍，Aβ、tau等大分子毒性物质难以从脑实质中排出［22-23］。mLV 功能障碍导致脑实质/脑间质液大分子流出和进入dCLN 减少，排出中枢大分子毒性物质的功能进一步下降［18］。本研究结果还显示，与LPS 组相比，注射MZA51 的小鼠用LPS 处理后，海马炎症因子水平增加，MG 活化增多，与认知损伤趋势一致，说明预先存在的mLV功能损伤导致大分子毒性物质在脑内累积，引起IL-6、IL-1β等炎症介质在海马中聚集，诱导MG活化，使LPS处理后的小鼠更容易出现认知功能障碍。

综上所述，LPS 诱导的中枢炎症损害mLV 转运功能，而mLV功能损伤增加IL-6和IL-1β聚集，增加MG活化，加重LPS诱导的认知功能障碍。但是除了影响炎症介质聚积和MG 活化，mLV 损伤是否通过影响其他通路对中枢炎症产生作用，目前尚不清楚，未来还需更多的实验进行分析和判断。