cGAS-STING通路介导酸性去氧胆酸诱导人正常食管上皮细胞炎症的机制研究

张丹萍，苏 鑫，朱 宏

南京医科大学第一附属医院消化内科，江苏 南京 210029

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是上消化道的慢性疾病，其发病率逐年升高［1］。反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是胃食管反流病的常见类型之一，盐酸及胆汁酸等反流物质的长期刺激会导致食管远端的炎症反应，并随着反流时程的延长进展至Barrett 食管甚至食管腺癌［2］。既往研究发现，暴露于酸性胆盐的食管上皮细胞炎症因子分泌显著增加［3］。然而，盐酸及胆汁酸诱导食管上皮炎症的确切机制尚未完全阐明，深入探讨介导食管上皮炎症的具体机制能为RE的治疗提供新的理论依据。

线粒体是内源性活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成的主要部位，大量ROS诱导的氧化应激会导致线粒体功能障碍。作为线粒体遗传物质存在的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）靠近呼吸链且缺乏保护性组蛋白，因此极易受到ROS的攻击，导致mtDNA 损伤并从线粒体释放到胞质中［4］。作为线粒体损伤相关分子模式（mitochondrial damageassociated molecular pattern，mtDAMP），mtDNA 可以通过结合模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）激活固有免疫系统［5-6］。

环鸟苷酸-腺苷酸合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）作为PRR 之一是胞质DNA 感受器，能识别并结合胞质双链DNA，催化ATP和GTP转化为环二核苷酸cGAMP，其作为第二信使结合并激活干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING），随后STING 招募并激活TANK 结合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）和IκB 激 酶（IκB kinase，IKK），这些激酶磷酸化并激活干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κb），促进Ⅰ型干扰素及其他细胞因子的表达。cGAS-STING 通路参与炎症性疾病、神经退行性疾病及肿瘤等多种疾病进程［7-9］。本研究拟探讨酸性DCA诱导食管上皮炎症过程中，mtDNA 损伤及释放与cGAS-STING 通路之间的联系，为酸性胆盐反流引起慢性食管炎症的发病机制提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常食管上皮细胞系（HEEC）购自美国ATCC。去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA，MedChemExpress公司，美国），CCK-8试剂盒（APE×BIO 公司，美国），ROS检测试剂盒、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒及ATP 检测试剂盒（上海碧云天科技公司），线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）Mitosox 荧光探针（Invitrogen 公司，美国），细胞基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技公司），HiScript®ⅡQ RT SuperMix 和ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南 京 诺唯赞公司）；cGAS抗体及γH2AX抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国），STING 抗体和TOMM20 抗体（Abcam 公司，美国），p-NF-κB p65 抗体和NF-κB p65抗体（上海Abmart公司），抗DNA抗体（Progen抗体，德国），β-actin抗体（北京博奥森生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理

使用含20%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，在5%CO2、37 ℃的培养箱中培养。当细胞生长至融合度达80%左右时传代并进行后续实验。酸性DCA溶液的配制如下：酸性培养基用36%～38%的浓盐酸在DMEM 培养基中滴定至pH=5，在此酸性培养基中加入一定量的DCA 贮备液配成含不同浓度DCA 的酸性培养基，充分混匀后即为酸性DCA 溶液。对照组即为不含DCA的中性培养基，即DMEM培养基［3］。

1.2.2 CCK-8实验检测细胞活性

HEEC 接种于96 孔板，1×105个/孔，贴壁生长24 h，酸性DCA组设置50、100、200、300 μmol/L 4个浓度及2、4、6、8 h 4个时间点，同时设置对照组及空白组，CCK-8 试剂盒测定细胞存活率，细胞存活率=［（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）］×100%。

1.2.3 流式细胞术检测ROS、mtROS和MMP

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，PBS润洗后胰酶消化离心，将探针稀释在特定溶液中孵育一定时间，孵育结束后离心并清洗，上机检测。

1.2.4 荧光显微镜检测ROS、mtROS和MMP

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，PBS润洗后加入荧光探针孵育，孵育结束后吸弃并清洗，荧光显微镜采集图像。

1.2.5 ATP检测

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，使用ATP检测试剂盒进行检测，配制不同浓度梯度的ATP标准溶液，绘制标准曲线，将ATP 检测工作液加入样品和标准品中，使用光度计检测相对光单位（relative light unit，RLU）值。BCA法检测蛋白浓度，ATP含量=ATP浓度/蛋白浓度。

1.2.6 细胞免疫荧光

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于共聚焦小皿，待细胞贴壁后给药处理，4%多聚甲醛室温固定20 min，0.1% Triton X-100 室温破膜15 min，5%BSA-PBS 室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，隔日二抗避光室温孵育1 h，DAPI 室温复染10 min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下采集图像。

1.2.7 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

TRIzol 法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度及纯度，按照逆转录试剂说明合成cDNA，以cDNA 为模板进行RT-qPCR 扩增。IL-1β上游引物：5＇-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3＇，下游引物：5＇-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3＇；IL-6上游引物：5＇-ACTCACCTCTTCAGAACGAATGG-3＇，下游引物：5＇-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3＇；以GAPDH 为内参，上游引物：5＇-ACCATCTTCCAGGAGCGAG-3＇，下游引物：5＇-GATGGCATGGACTGTGGTCA-3＇。RT-qPCR 反应条件：预变性95 ℃30 s；40 次循环反应95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃变性15 s。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

1.2.8 mtDNA拷贝数测定

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于6 孔板，待细胞贴壁后给药处理，按照细胞基因组DNA 提取试剂盒说明书进行DNA 提取，紫外分光光度计测定DNA 浓度及纯度，以基因组DNA为模板进行RT-qPCR 扩增，mtDNA 拷贝数的检测以细胞核DNA 作为参照，B2M 基因代表细胞核DNA，ND1 及ND2 基因代表mtDNA。ND1 上游引物：5＇-CTCTTCGTCTGATCCGTCCT-3＇，下游引物：5＇-TGAGGTTGCGGTCTGTTAGT-3＇；ND2 上游引物：5＇-GTAGACAGTCCCACCCTCAC-3＇，下游引物：5＇-TTGATCCCGTTTCGTGCAAG-3＇；B2M 上游引物：5＇-CCAGCAGCGAATGGAAAGTCAA-3＇，下游引物：5＇-TCTCTCTCCATTCTTCAGTAAGTCAACT-3＇。

1.2.9 Western blot

RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度并确定上样量，SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳结束后冰浴转膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，隔日二抗室温孵育1 h，ECL 化学发光显影。

1.3 统计学方法

所有数据均使用GraphPad Prism8 软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事后比较采用Tukey 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酸性DCA对HEEC细胞形态和存活率的影响

倒置显微镜下观察酸性DCA（100 μmol/L）处理前后HEEC形态变化，对照组中，细胞贴壁生长且状态良好，形态饱满。随着药物作用时间的延长，细胞逐渐皱缩，空泡增多（图1A）。为了探究酸性DCA对HEEC 存活率的影响，将不同浓度酸性DCA 溶液处理细胞2、4、6、8 h，CCK-8 法检测细胞存活率，结果如图1B所示，HEEC的存活率随着浓度的增加及暴露时间的延长而降低，呈浓度-时间依赖性。当干预浓度为200 μmol/L 及300 μmol/L 时，细胞存活率极显著降低。当干预浓度为50 μmol/L及100 μmol/L 时，与对照组相比，细胞存活率下降，且差异具有统计学意义（P＜0.001），依据既往研究［10-11］，本研究中选择100 μmol/L作为后续实验的干预浓度。

图1 酸性DCA处理后HEEC存活率及形态变化Figure 1 Viability and morphological changes of HEEC treated with acidic deoxycholic acid

2.2 酸性DCA诱导HEEC线粒体功能障碍

用酸性DCA（100 μmol/L）处理HEEC 2 h 后，荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞内ROS、mtROS 和MMP 水平。如图2A～F 所示，与对照组相比，酸性DCA 处理后细胞内ROS 及mtROS 水平显著升高，MMP 显著降低。用酸性DCA（100 μmol/L）处理HEEC 4 h 后，如图2G 所示，与对照组相比，酸性DCA 刺激后细胞ATP 水平降低。运用透射电镜观察线粒体超微结构，如图H 所示，对照组线粒体结构完整，轮廓清晰，线粒体嵴排列有序，基质均匀；酸性DCA 处理后线粒体外形肿胀，线粒体嵴排列紊乱，稀疏，线粒体出现空泡化。上述结果表明，酸性DCA 诱导HEEC 线粒体形态改变及功能障碍。

图2 酸性DCA处理后对HEEC线粒体功能和结构的影响Figure 2 Effects of acidic deoxycholic acid on mitochondrial function and structure of HEEC

2.3 酸性DCA 导致HEEC DNA 双链断裂及mtDNA拷贝数减少及释放

用酸性DCA（100 μmol/L）处理HEEC 4 h 后，荧光显微镜下观察γH2AX 阳性细胞，结果如图3A 所示，与对照组相比，酸性DCA 处理后γH2AX 阳性细胞数显著增加。Western blot 结果如图3B 所示，γH2AX 蛋白表达水平高于对照组。为了验证酸性DCA 处理后mtDNA 是否从线粒体释放到胞质中，RT-qPCR 检测mtRNA 基因ND-1、ND-2 相对细胞核DNA 基因B2M 的表达水平，结果显示，酸性DCA 处理后mtDNA 拷贝数显著降低（图3C）。进一步用荧光显微镜观察了线粒体与DNA 共定位情况，如图3D 所示，对照组中，mtDNA 位于线粒体内部，酸性DCA 处理后mtDNA 从线粒体释放到胞质中。上述结果表明，酸性DCA 诱导HEEC 双链DNA 断裂，导致DNA损伤，mtDNA释放至胞质中。

图3 酸性DCA处理对HEEC mtDNA的影响Figure 3 Effects of acidic deoxycholic acid on HEEC mtDNA

2.4 酸性DCA激活cGAS-STING信号通路

用酸性DCA（100 μmol/L）处理HEEC 4 h 后，与对照组相比，酸性DCA 组cGAS、STING 及p-NF-κB p65蛋白表达增加，RT-qPCR结果显示炎症因子IL-6及IL-1β表达水平增加（图4A、B）。cGAS 抑制剂RU.521 预处理抑制了酸性DCA 诱导的cGAS、STING及p-NF-κB p65表达水平的升高，同时炎症因子IL-6及IL-1β表达水平降低（图4C、D）。

图4 酸性DCA刺激对cGAS-STING信号通路的影响Figure 4 Effects of acidic deoxycholic acid on cGAS-STING signaling pathway

3 讨论

GERD 是全球最常见的慢性疾病之一，具有死亡率低但发病率高的特点，RE是GERD常见的类型之一［1］。研究表明，酸性胆盐刺激食管上皮细胞分泌IL-8及IL-1β等细胞因子［3］，MAPK、PKC及PKA等信号通路介导了这一过程［10-11］。本研究采用酸性DCA 刺激人正常食管上皮细胞的方法初步模拟RE的发生发展过程，探讨mtDNA 损伤及释放与cGASSTING 通路在食管上皮炎症中的关联。结果表明，酸性DCA诱导线粒体功能障碍，进一步导致mtDNA双链断裂及释放，激活cGAS-STING 通路，促进下游炎症因子的分泌。

近年来，线粒体在疾病发生发展中的作用备受关注。内源性ROS主要在线粒体呼吸链上产生，在正常机体内，ROS 的产生和清除受到严格控制，当体内氧化和抗氧化系统处于失衡状态时，ROS 的清除受限从而在体内蓄积，导致细胞毒性及组织和机体损伤［12］。既往研究表明，酸性胆盐诱导Barrett 食管上皮细胞线粒体氧化应激，在食管腺癌发展过程中起重要作用［13］。本研究发现酸性DCA 诱导ROS及mtROS 产生增多，MMP 降低以及ATP 生成减少，提示氧化应激的发生并进一步导致线粒体功能障碍。

DNA 损伤与各种疾病的发病机制相关，导致细胞稳态失衡，诱导炎症、细胞凋亡和衰老［14-15］。mtDNA 以环状双链DNA的形式存在，对机体正常生命活动至关重要。由于mtDNA缺乏保护性组蛋白，靠近ROS 产生部位且修复能力有限，mtDNA 比核DNA（nuclear DNA，nDNA）更容易受到ROS 的攻击［16］。既往研究发现，酸性胆盐在下咽癌癌变过程中诱导氧化应激和DNA 损伤［17］。本研究发现酸性DCA 诱导细胞氧化应激，γH2AX 表达水平升高，提示ROS 攻击DNA 并造成双链断裂。DNA 双链断裂（DNA double strand break，DSB）是最严重的损伤形式且难以完全修复，当损伤持续发生时，会引起大量异常DNA在细胞内蓄积［18］。

真核细胞DNA存在于细胞核与线粒体，病理情况下，高水平氧化应激可诱导线粒体功能障碍，增强线粒体通透性转变，导致DNA损伤并从线粒体泄漏到胞质中［19］。胞质双链DNA 可作为DAMP 被PRR 之一的cGAS 检测到。既往研究发现，化疗药伊利替康会引起DNA 损伤和双链DNA 释放，激活cGAS-STING 通路从而导致肠黏膜炎［20］。本研究探讨了酸性DCA 刺激后mtDNA 拷贝数及线粒体与DNA的共定位，结果表明mtDNA拷贝数减少并从线粒体释放到胞质中，提示mtDNA损伤后从线粒体释放，进而激活了cGAS-STING通路。

NF-κB 是促炎基因表达的关键调节器之一，诱导促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 及TNF-α的转录［21］。既往研究证明，盐酸通过激活NF-κB通路刺激人食管上皮细胞系（Het-1a）分泌炎症因子［11］。暴露于过量锰可通过激活cGAS-STING/NF-κB通路诱导神经炎症［22］。RU.521 是应用广泛的cGAS 抑制剂，可强效且选择性抑制人和鼠的cGAS 酶活性和下游炎症发生［23］。RU.521 能抑制小鼠脑静脉窦血栓模型中被激活的cGAS-STING/NF-κB通路以及下游炎症因子的分泌，改善神经功能障碍［24］。本研究发现，酸性DCA 通过间接方式激活NF-κB 通路，即cGAS-STING/NF-κB 通路，并促进炎症因子IL-6及IL-1β的分泌，cGAS 抑制剂RU.521 处理后cGAS及STING的表达水平降低及p-NF-κB-p65表达水平被部分抑制，炎症因子IL-6及IL-1β分泌减少。上述结果表明NF-κB介导的cGAS依赖性炎症反应可能在酸性DCA诱导的食管上皮细胞炎症中起重要作用。

综上所述，本研究发现，酸性DCA 诱导人正常食管上皮细胞线粒体功能障碍，进一步导致mtDNA损伤及释放，从而激活cGAS-STING 通路，抑制cGAS的激活可部分抑制酸性DCA诱导的人正常食管上皮细胞炎症，提示针对cGAS 的靶向干预有望成为临床治疗RE的新靶点。