不同生长年限北苍术次生代谢物累积对土壤矿质元素的响应

谷仙，赵艳云，张建云，王乾，郑玉光，房慧勇

(1. 河北中医学院药学院，河北石家庄 050200；2. 河北省中药炮制技术创新中心，河北石家庄 050200；3. 河北化工医药职业技术学院，河北石家庄 050026)

中药苍术为多年生菊科植物茅苍术[Atractylodes lancea(Thunb.) DC. ] 或北苍术[Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.]的干燥根茎，味辛、苦，性温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目等药效《中华人民共和国药典(2020版)》。 受新型冠状病毒疫情(COVID－19)等影响，近年来苍术的市场需求不断扩大，主流品种以北苍术为主，但质量参差不齐。 自然界中苍术为多年生药用植物，主要分布于河北、内蒙古等地区，繁殖能力弱和无节制采挖等因素导致该植物野生资源日益枯竭。 为保护北苍术自然种群，减少环境破坏，如何通过人工栽培技术保证北苍术质量成为科研人员亟待解决的核心问题[1]。

肥料组成及用量直接决定苍术外部形态特征和次生代谢产物的差异。 有研究表明，低或高浓度氮素均会加速北苍术细胞膜结构损伤，加重连作障碍的发生，次生代谢产物甚至低于野生苍术[2－4]。 但也有研究发现低pH 值提高了苍术根中β－桉叶醇含量[5]。 大田试验发现北苍术在施用氮肥(N)180 kg/hm2、磷肥(P2O5)225 kg/hm2、钾肥(K2O)105 kg/hm2情况下药用成分含量最高[6]。 增施钾肥可以提高药用植物干物质生产能力和根系产量[7]。 喷施锌肥有助于提高关苍术白术内酯Ⅱ和苍术素含量，硼肥能显著提高关苍术花粉活力、花粉数量、结实率及百粒重等[8]。目前，多数研究停留在施肥对苍术生长的短期影响，不同生长年限的北苍术次生代谢产物积累对土壤矿质元素的响应尚不明确。 为此，本试验以一年生、三年生和七年生北苍术为研究对象，分析其主要药用成分的差异，通过比较土壤中矿质元素和北苍术次生代谢产物积累的特征，明确土壤矿质元素对北苍术药用成分影响的关键因子，以期为我国优质北苍术生产提供理论借鉴。

1 材料与方法

1.1 种植地概况及试验管理

种植基地位于河北省承德市隆化县白虎沟村(117.078072°E，40.150558°N)。 该地区属于温带大陆性季风气候，四季分明、雨热同季，光照充足，多年平均日照时数2 665.7 h，年均气温7.5℃，无霜期约153 d，年均降水量505.2 mm，属于北苍术主要道地产区之一。 该基地种植一年生、三年生和七年生苍术，肥料、灌溉和除草等统一管理。 苍术生长季施用氮肥(N)220 kg/hm2、磷肥(P2O5)190 kg/hm2、钾肥(K2O)105 kg/hm2。

1.2 样品采集

于2020 年10 月中旬北苍术收获期，按照五点取样法采集土壤样品，每处理重复3 次。 用土钻钻取0～20 cm 土样，充分混合后采用四分法取舍。 将土样充分混匀后，剔除其中石块和动植物残体等杂质，带回实验室。 土样平铺于阴凉处自然风干，研磨，过0.15 mm 孔径筛，留存待测。

在对应土壤样点处采集不同生长年限的北苍术，选取长势基本一致、无病虫害的健壮植株，经河北中医学院郑玉光教授鉴定为北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.。 将北苍术根茎带回实验室除去泥沙，自然阴干，撞掉须根，粉碎，过三号筛，用于各指标测定。

1.3 测定项目及方法

土壤pH 测定用电位法(土水比1 ∶2.5)，即准确称取10.0 g 过筛鲜土放入烧杯中，加入25 mL经过煮沸后静置至常温的去离子水，充分振荡1 min，静置30 min 后使用pH 计测定。 参照鲁如坤[9]的方法测定土壤养分含量。 土壤有机碳采用重铬酸钾氧化－外加热法测定，用FeSO4标准溶液滴定剩余的重铬酸钾，并计算出有机碳含量。土壤全氮采用凯氏定氮法，借助FOSS KJELTEC 8200 测定，全磷、全钾和锌、氯、铜等元素采用电感耦合等离子质谱(ICP－MS)法测定。

供试仪器及标准品:LC－20AD 高效液相色谱仪(日本岛津公司)，KQ－300VDE 型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BSA224S－CW 电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。 苍术素(批号:MUST－19051602，纯度≥99.89%)，β－桉叶醇(批号:MUST-1911262，纯度≥99%)， 白术内酯Ⅰ(批号: MUST －19101112，纯度≥99.75%)，以上对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。 乙腈为色谱纯(Fisher Scientific Co. Ltd.)，水为Milli－Q 自制水，其他试剂均为分析纯。

采用高效液相色谱法测定北苍术样品中β－桉叶醇、白术内酯Ⅰ、苍术素三种有效成分含量。色谱柱:Inertsil ODS－3 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:乙腈(B) －0.1% 甲酸水溶液(A)；梯度洗脱(0 ～30 min，50%B；30 ～35 min，52%B；35～45 min，55%B；45～48 min，58%B；48 ～58 min，60%B；58 ～70 min，80%B；70 ～75 min，82%B)；流速:1.0 mL/min；检测波长:220 nm(白术内酯Ⅰ，45 ～55 min)，203 nm(β－桉叶醇，55 ～60 min)，340 nm (苍术素，60 ～70 min)；柱温:25℃；进样量:10 μL。 方法学考察结果显示苍术素精密度、重复性、稳定性RSD 分别为1.28%、0.85%、1.51%；白术内酯Ⅰ精密度、重复性、稳定性RSD 分别为1.34%、0.98%、1.72%；β－桉叶醇精密度、重复性、稳定性RSD 分别为1.47%、1.43%、1.87%； 加样回收率分别为99. 98%、99.86%、100.08%，RSD 分别为1.95%、0.98%、1.29%；线性关系:Y苍术素＝1×108X＋621976，R2＝0.9998；Y白术内酯Ⅰ＝4×107X＋189482，R2＝0.9997；Yβ－桉叶醇＝2×107X＋283364，R2＝0.9997。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2019 整理，SPSS 22.0 软件进行统计分析，Duncan’s 新复极差法进行差异显著性分析(P＜0.05)，OriginPro 2019 软件绘图。 采用Pearson 法进行相关性分析， Canoco 5.0 软件进行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。

2 结果与分析

2.1 不同生长年限北苍术土壤pH 值及矿质元素含量

由表1 看出，随着生长年限的延长，北苍术土壤pH 值呈显著下降趋势，七年生北苍术土壤pH 值较一年生低3.23%。 七年生和三年生北苍术土壤有机碳含量显著低于一年生，其中七年生土壤有机碳含量下降6.81%。 土壤全氮和全磷含量与土壤有机碳相反，均呈增加趋势。 土壤全氮含量从1.06 g/kg 增加到1.24 g/kg，但是不同生长年限土壤全氮含量差异均不显著；土壤全磷含量存在显著差异，其中七年生土壤全磷含量较一年生高17.39%。三年生土壤全钾含量显著高于一年生和七年生，一年生虽然低于七年生，但二者差异不显著。

表1 不同生长年限北苍术土壤理化性状 (g/kg)

由表2 可以看出，一年生北苍术土壤中氯含量最高，但与三年生和七年生差异不显著。 一年生和三年生北苍术土壤中钠含量均显著高于七年生，分别为1.27 mg/kg 和1.25 mg/kg。 对微量元素而言，不同生长年限北苍术土壤中含量有差异。其中七年生北苍术土壤中锌含量最高，达到66.74 mg/kg，比一年生显著高5.79%。 七年生土壤中铜含量比一年生高7.41%；铅含量为一年生最高，其次是七年生，三年生最低，为27.33 mg/kg，但两种元素不同生长年限间差异均不显著；土壤中铬含量表现为三年生最低，七年生最高，达到62.53 mg/kg，显著高于一年生和三年生北苍术土壤中铬含量。

表2 不同生长年限北苍术土壤矿质元素含量 (mg/kg)

2.2 不同生长年限北苍术次生代谢产物的差异分析

比较不同生长年限下北苍术干燥根茎的次生代谢产物含量发现，三年生北苍术的苍术素、白术内酯Ⅰ和β－桉叶醇含量均最高(图1)。 三年生北苍术的苍术素含量达到0.69%，显著高于一年生和七年生，七年生苍术素含量最低，为0.24%。一年生和七年生白术内酯Ⅰ含量接近，差异不显著，分别比三年生显著低47.20%和49.50%。 就β－桉叶醇而言，尽管三年生北苍术中含量最高(0.78%)，但是与一年生差异不显著，仅比一年生高1.8%；七年生北苍术β－桉叶醇含量均显著低于一年生和七年生，为0.52%。

图1 不同生长年限北苍术次生代谢产物差异比较

2.3 北苍术次生代谢产物对土壤矿质元素的响应

土壤矿质元素与北苍术次生代谢产物的相关性分析结果(图2)显示，土壤有机碳含量显著影响北苍术中β－桉叶醇含量，土壤全磷含量则与β－桉叶醇含量呈显著负相关，土壤全钾含量与苍术素、白术内酯Ⅰ呈显著正相关。

图2 土壤矿质元素与北苍术次生代谢产物的相关性分析

冗余分析发现，前两轴共解释变量的94.8%，其中，第一轴解释变量的86.2%，第二轴解释变量的8.6%(图3)。 对北苍术次生代谢成分而言，重金属铬与北苍术药用成分含量呈显著负相关，其次是锌。 土壤全钾含量对北苍术根茎药用成分含量影响最大，但未达显著水平， 其次为钠、pH 值和有机碳(SOC)。

图3 土壤矿质元素与北苍术次生代谢产物的冗余分析

3 讨论

随着对苍术研究的不断深入，已从苍术中分离出了200 多种化合物，主要为萜类和烯炔类[10 [。 《中华人民共和国药典(2020 版)》规定，本品按干燥品计算，苍术素(C13H10O)含量不得少于0.30%。 本试验结果表明，随着生长年限延长，北苍术主要药用活性成分含量先升高后降低，一年生、三年生和七年生苍术素含量均超过药典规定标准，三年生苍术素、白术内酯Ⅰ和β－桉叶醇含量均为最高。 这与崔馨月[8]研究发现三年生根茎中苍术酮含量高于四年生和五年生的结论基本一致。 原因可能与连续施用化肥加剧北苍术连作障碍有关，造成北苍术土壤微环境恶化。 有报道指出河北北部和辽西的北苍术品质较好[11]。如果为了追求短期产量而无节制施用化肥，忽视道地药材产区土壤质量的提升，势必导致苍术产业的不良循环。 土壤矿质元素不仅影响中药材产量和品质，还会影响土壤及植物－植食性昆虫－天敌的营养关系及药用植物微生态系统[12]。 因此，加强北苍术道地产区生态种植模式研究至关重要，金永超[13]采用生物质炭浸提液对茅苍术进行灌根，显著增加了茅苍术中苍术素含量。 有学者发现茅苍术和花生间作能够提高花生产量，降低连作土壤酚酸类物质含量，调控花生土壤微生物群落组成[14]。

本研究表明土壤全钾含量对北苍术次生代谢产物累积正向影响最大。 前人研究也发现类似结果，如低钾胁迫下茅苍术叶片光合受阻，导致挥发油主要成分β－桉叶醇、茅苍术醇含量降低[15]。另一方面，钾素能够协同其他营养元素共同提升药用植物质量，杨燕燕[16]研究表明施钾量与苍术不同部位的含氮量呈正相关。 杨雪等[7]指出当前钾素对药用植物的研究多集中在药材产量、有效成分含量及生理代谢等方面，未来应加强钾素对药效成分及体内代谢与基因调控的研究。 近年来药理活性研究发现苍术还具有降血糖、抗菌抗炎、心血管保护和抗肿瘤等作用[17，18]。 对北苍术而言，需要明确人工栽培中钾肥最佳施用量，进一步研究钾素调控北苍术中苍术素、白术内酯Ⅰ等药用成分的内在机制。

微量元素是药用植物生长发育中不可或缺的，土壤中微量元素供给水平将直接影响北苍术品质形成。 适量铜肥能显著提高关苍术超氧化物歧化酶活性、筒长、花冠长度、花冠宽度、花粉数量[19]，而对于关苍术苍术酮、白术内酯Ⅱ和β－榄香烯来说锌肥是关键因素[8]。 对药用植物来说，微量元素越多并不意味着药材质量越好，同时也面临着重金属污染的风险。 本研究中，土壤重金属铬(Cr)、锌(Zn)、铜(Cu)和铅(Pb)元素含量虽然均未超过我国当前规定的农用地土壤环境质量标准[20]，但相关性分析表明铬(Cr)、锌(Zn)和铜(Cu)元素与北苍术药用成分呈负相关，这可能与复合肥中含有重金属元素有关，并且随着化肥施用年限的延长，农田中Cr、Cu 和Zn 元素含量呈现累积态势。 因此，对于以地下根茎入药的北苍术而言，必须高度重视土壤潜在的重金属污染风险，提倡有机肥改良土壤和有机－无机肥料配施改良土壤微生态环境。

4 结论

随着北苍术生长年限的延长，土壤矿质养分的变化不尽相同。 连续施用化肥导致北苍术土壤pH 值和土壤有机碳含量均呈下降趋势，而土壤全氮和全磷含量则呈现增加趋势；土壤中钾元素是正向影响北苍术次生代谢产物的关键因子，铬和锌元素等则对北苍术品质产生一定负效应。 就本研究所涉及的药用成分来讲，生长年限越长并不意味着北苍术活性物质含量越高，而以三年生北苍术质量最好，其苍术素、白术内酯Ⅰ和β－桉叶醇含量均高于一年生和七年生。 未来应加强北苍术的生态友好型种植模式研究，避免滥用化肥影响北苍术质量。