五种昆虫脱皮抑制剂与莱氏绿僵菌的相容性研究

张希鹏，王世贤，李学文，于妙荣，聂玉恒，任宪銮，刘守柱

(1. 聊城大学农学与农业工程学院， 山东聊城 252000；2. 福建农林大学植物保护学院，福建福州 350002)

昆虫病原真菌是最早被鉴定为昆虫病原的微生物，也是一种可开发为环境友好型生物农药的重要资源。 如今越来越多的昆虫病原真菌，如球孢白僵菌(Beauveria bassiana)[1－3]、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)[4－6]、 淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)[7]等被广泛应用于农田、温室等的害虫防治中。 大量研究表明，利用昆虫病原真菌防治害虫不但对环境友好，而且不会引起害虫的抗药性，不杀伤天敌，对人畜安全，是一种绿色有效的方法[8－10]。 莱氏绿僵菌(M.rileyi)是一种昆虫病原真菌，其寄主范围广泛，可以寄生在30 多种鳞翅目害虫上[11－13]，自然条件下可在害虫种群内形成侵染循环，引起昆虫的田间流行病，能够有效降低种群密度，具有很强的致病力，是极具开发潜力的虫生真菌之一。

不同病原真菌的杀虫效果差异较大，并容易受到环境影响[14，15]。 虽然绿僵菌制剂已被联合国粮食与农业组织(FAO)推荐为环保产品并推广应用[16，17]，但与其他真菌一样，莱氏绿僵菌也存在击倒害虫时间长、杀虫速率低下、受环境影响较大等弊端，尤其当虫口密度较大时，不能及时压低虫口、减少损失。 为了提高杀虫效果，现阶段多将莱氏绿僵菌与其他药剂混用以达到增强致病力的目的，但虫生真菌与化学农药的混用不能盲目进行，需要提前进行二者的相容性测定。 已有研究表明，昆虫病原真菌与大部分化学农药相容性较差[18－22]，与绿色农药的相容性较好[23，24]，因而绿色农药与昆虫病原真菌复配是未来的应用方向。

虱螨脲、氟啶脲等是作用于昆虫脱皮过程的一种绿色农药，具有低毒、低残留的特点，对人和牲畜相对安全，对环境友好，且害虫对其不易产生抗性，已成为当前农林害虫综合治理中不可或缺的重要组成部分。 为明确莱氏绿僵菌与虱螨脲等绿色农药混用的可能性，本试验选择5 种常用昆虫脱皮抑制剂，研究该类药剂与莱氏绿僵菌的相容性，并筛选相容性好的药剂，为下一步与莱氏绿僵菌的复配提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:莱氏绿僵菌Nr5772 菌株，源自于美国佛罗里达大学昆虫病理实验室，并在聊城大学昆虫实验室内用萨氏麦芽糖酵母琼脂固体培养基(SMAY)培养，－20℃冷藏保存。 由于长时间人工培养菌株会出现毒力衰退的现象，为保证其毒力，试验开始前先接种到草地贪夜蛾幼虫体内，幼虫死亡后从僵虫上分离孢子，纯化、复壮后备用。

SMAY 培养基:蛋白胨5 g、麦芽糖5 g、酵母粉5 g、琼脂6 g，用蒸馏水定容至500 mL，121℃灭菌20 min。

昆虫脱皮抑制剂:94%氟啶脲、98%虱螨脲、94%氟铃脲、95%灭幼脲和98%吡丙醚，均为原药，由青岛瀚生生物科技股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 药剂剂量设置 在中国农药信息网查找5种供试药剂的田间使用剂量，以田间使用剂量为基准，设置4 倍、2 倍、1 倍、50%、25%共5 个浓度梯度，以丙酮作为溶剂，配制各浓度药液(表1)。

1.2.2 脱皮抑制剂对莱氏绿僵菌菌丝生长的影响 取复壮完成的莱氏绿僵菌新鲜孢子，用0.1%吐温80(无菌水配置)配制浓度为1×106个/mL的分生孢子悬浮液待用。 根据表1 配制各浓度药剂，移液枪吸取300 μL 药液加入SMAY 平板中，并用玻璃棒涂布均匀，以涂布丙酮为对照。 静置10 min 待丙酮完全挥发后，用移液枪将分生孢子悬浮液接种至不同平板中，每皿接种3 滴，每滴3 μL(液滴圆形)，液滴呈三角形排列。 静置20 min密封平板，将平板置于光照培养箱内培养(25℃，光周期L ∶D＝12 h ∶12 h)。 每个药剂浓度重复3次。

培养第4 天后平板出现较为明显的菌落，采用十字交叉法测量各菌落直径，以每皿3 个菌落直径的平均值作为菌落的原始直径，以第14 天平均菌落直径作为最终值，计算菌落直径增长量。

菌落直径增长量(cm)＝第14 天菌落平均直径－第4 天菌落平均直径。

1.2.3 昆虫脱皮抑制剂对莱氏绿僵菌产孢量的影响 基于1.2.2 菌落直径测定完成后，用0.1%吐温80 将每皿平板内的所有孢子充分洗脱，转移至离心管内定容至10 mL，漩涡振荡器上充分混匀后过滤，在显微镜下用血球计数板计数。 每个浓度处理取3 皿平板，计数平均产孢量，计算产孢抑制率。

产孢抑制率(%)＝(对照组产孢量－处理组产孢量)/对照组产孢量×100 。

1.2.4 昆虫脱皮抑制剂对莱氏绿僵菌孢子萌发的影响 取新鲜绿僵菌孢子，用0.1%吐温80 配制成浓度为1×108个/mL 的分生孢子悬浮液备用。 称取100 mg 原药，加入2 mL 吐温80 充分搅拌至糊状，然后加入少量丙酮搅拌至完全溶解，加入0.1%吐温80 定容至50 mL，配制成高浓度的药剂母液备用。 取适量药剂母液，用孢子悬浮液分别稀释成田间剂量4 倍、2 倍、1 倍、50%、25%浓度的梯度药液(表1)，以不含药的液体作为对照，180 r/min、25℃摇床振荡培养48 h 后用血球计数板统计孢子萌发数量，每浓度重复3 次，计算孢子萌发抑制率。

孢子萌发抑制率(%)＝(检查的总孢子数－萌发孢子数)/检查的总孢子数×100 。

1.3 数据处理与分析

试验数据用SPSS 26.0(IBM)软件进行分析处理，采用Duncan’s 新复极差法分析比较差异显著性(P＜0.05)，用Graphpad Prism 8 作图。

2 结果与分析

2.1 5 种昆虫脱皮抑制剂对莱氏绿僵菌菌丝生长的影响

莱氏绿僵菌孢子接种到带药平板后，第4 天左右即可见到明显菌斑，此后菌丝越来越浓密，菌落直径缓慢增大，与对照相比，菌落直径没有明显变化，说明在供试剂量范围内，莱氏绿僵菌在5 种药剂平板中均可生长。 对各处理的菌落增长量进行方差分析，结果表明，各药剂不同浓度处理与对照间的菌落直径差异均不显著(图1)，说明莱氏绿僵菌对5 种昆虫脱皮抑制剂的敏感性不强，适应范围比较广，即使在4 倍田间剂量下菌丝的营养生长依然没有受到抑制。

图1 莱氏绿僵菌经5 种昆虫脱皮抑制剂处理的菌落直径增长量

2.2 5 种昆虫脱皮抑制剂对莱氏绿僵菌产孢量的影响

数据分析结果(图2)表明，氟啶脲、虱螨脲和灭幼脲3 种药剂处理的产孢量较高，与对照组无显著差异，说明在试验剂量范围内，这3 种药剂对莱氏绿僵菌的生殖生长没有不利影响。 氟铃脲和吡丙醚处理的孢子产量较低，在25%田间剂量浓度下，抑制率分别为66.97%、39.74%，在田间剂量浓度下抑制率分别为68.92%、54.50%，在4 倍田间剂量浓度下抑制率分别为83.70%、61.05%；各浓度处理均显著低于对照组，并呈现药剂浓度越高抑制性越强的趋势。

2.3 5 种昆虫脱皮抑制剂对莱氏绿僵菌孢子萌发的影响

氟啶脲、虱螨脲和灭幼脲3 种药剂各浓度处理孢子均正常萌发，萌发量与对照组无显著差异，虱螨脲甚至还呈现出随着浓度的升高促进孢子萌发的现象(图3)。 氟铃脲和吡丙醚处理的孢子萌发数量显著低于对照组，表现出较强的抑制性，且随着药剂浓度升高，对孢子萌发的抑制作用越强。在25%～4 倍田间浓度下，氟铃脲对莱氏绿僵菌孢子的萌发抑制率为39.08%～68.69%，吡丙醚的抑制率为35.06%～60.45%。

图3 莱氏绿僵菌经5 种昆虫脱皮抑制剂处理的孢子萌发量

3 讨论与结论

害虫防治一直是农业生产中的重要内容，也是农业丰产、丰收的重要保障。 目前对农业害虫的防治主要还是大量采用化学药剂，但化学农药使用的弊端日趋明显，不符合绿色农业、生态农业的发展趋势，因而亟需开发环境友好的绿色新型农药。 随着农业技术的发展，越来越多的真菌制剂、植物农药等绿色农药相继问世，其中以白僵菌、绿僵菌为代表的真菌类生物农药，以其良好的防治效果和安全性而得到广泛应用。 我国从20世纪70 年代就开始运用绿僵菌防治农业害虫[25]，在绿僵菌的应用和研究方面积累了丰富经验。 但是真菌杀虫剂存在见效慢和受环境影响大的缺点，这阻碍了绿僵菌的进一步应用。

解决昆虫病原真菌杀虫速度慢的措施之一是与化学农药复配使用。 李敏等[26]研究发现，昆虫真菌与杀虫剂的相容性高于与杀菌剂的，且低浓度优于高浓度；与化学药剂复配后对真菌的防治效果也具有一定的增效作用[27，28]。 昆虫脱皮抑制剂作为一类作用机制独特的绿色农药，不但在生产上有广泛的应用，而且也是常用的复配药剂，但该类药剂与昆虫病原真菌的复配却鲜有研究。与昆虫脱皮抑制剂联合使用是提高莱氏绿僵菌杀虫速度的新途径，但首先需要明确二者之间有无抑制或拮抗作用。

本研究选择了5 种可以延缓或抑制昆虫脱皮的药剂，从菌落直径、孢子产量、孢子萌发量三方面评估药剂与莱氏绿僵菌的相容性。 结果表明，氟啶脲、虱螨脲和灭幼脲与莱氏绿僵菌的相容性较好，对菌丝生长、产孢量和孢子萌发均没有抑制作用，虱螨脲还可以在一定程度上促进孢子萌发，因而可以与莱氏绿僵菌复配使用。 氟铃脲和吡丙醚虽然对莱氏绿僵菌菌丝生长没有抑制作用，但对孢子萌发和产孢量具有很强的抑制作用。 由于莱氏绿僵菌的致病机理主要是通过孢子萌发穿透体壁来侵染寄主[29]，而氟铃脲和吡丙醚对孢子萌发具有很强的抑制性，会严重影响莱氏绿僵菌的侵染成功率，导致防治效果下降，因而不宜作为复配药剂使用。

本研究结果表明，氟啶脲、虱螨脲和灭幼脲与莱氏绿僵菌均有很好的相容性，下一步可以进行两者的复配研究以提高莱氏绿僵菌的杀虫效率，既满足现代农业对生物防治手段的要求，又可以提高生产效率和产品品质。 此外，本研究也可为其他病原真菌，如白僵菌的复配应用提供新的研究思路，对提高生物防治效果、减少化学药剂的使用具有深远意义。