鲜果槟榔前处理工艺对槟榔饮片中生物碱含量的影响

谷 威，王高烽，孔丹丹，骆骄阳，李锦萍，马永贵，杨美华

（1.青海师范大学生命科学学院，青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193）

槟榔（Arecae semen） 为多年生常绿棕榈科植物槟榔（Areca catechu L.） 的干燥成熟种子，为我国著名的四大南药（槟榔，益智，砂仁，巴戟天） 之一，具有较大的药食两用价值[1]。槟榔在《中华人民共和国药典》 1953 年版中就有收载记录，且在2015年版《中华人民共和国药典》一部收载的槟榔相关饮片及成方制剂多达60 余种[2]。槟榔具有驱虫、利水行气、消积等功效，在临床中多用于治疗蛔虫、绦虫病，腹胀痛，疟疾等疾病[3]，有文献表明，其主要功效成分即为槟榔中的多种生物碱，主要包括槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱和去甲基槟榔次碱等。同时，上述生物碱也具有一定的毒副作用[4-5]。通常，槟榔饮片的加工需将鲜果槟榔经过前处理加工制得，其过程主要包含浸泡、晾晒、煮洗、脱油和仓储的5 个关键环节[6-8]，其中生物碱含量也随之动态变化[9]。

截至目前，国内外研究多集中于食品槟榔中的生物碱含量分布特点，药用槟榔饮片的药效活性，及生物碱致癌性风险的安全性评价等领域[10-13]，尚未系统分析鲜果槟榔在前处理加工过程中4 种生物碱含量变化的规律研究，而槟榔中生物碱含量直接影响其质量及安全性等级。通过分析药用槟榔饮片生产加工过程中的4 种生物碱含量变化，了解初加工过程干扰水平，以期为槟榔饮片的药效价值及安全性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品收集

槟榔鲜果，采自我国云南及海南省，共16 批次。

1.2 仪器与试剂

LC-20AT 型高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；THZ-D 型恒温振荡器，苏州培英实验设备有限公司产品；SB-5200D 型KQ-500 超声仪，昆山市超声仪器有限公司产品；AB135-S 型电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司产品。

氢溴酸槟榔碱对照品CHB-Q-036、去甲槟榔碱对照品CHB-Q-043、槟榔次碱对照品CHB-B-088、去甲槟榔次碱盐酸盐对照品CHB-Q-042，成都克洛玛生物科技有限公司提供，甲醇为色谱纯，美国Fisher 公司提供；分析纯的甲醇、三氯甲烷和氨水，北京化工厂提供；水，娃哈哈饮用纯净水提供。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品及供试品溶液

分别精密称定槟榔次碱、去甲槟榔次碱、槟榔碱和去甲槟榔碱对照品适量，使用50%甲醇溶解制备得到对应单标储备液。移取各储备液适量，甲醇稀释单标储备液，分别得到槟榔次碱、去甲槟榔次碱、槟榔碱和去甲槟榔碱的质量浓度为121.220，114.650，754.300，184.709 μg/mL 的混合对照品溶液。称取0.5 g 槟榔粉末至100 mL 锥形瓶中，加入1 mL 氨水浸润30 min，加入三氯甲烷- 甲醇（4∶1） 40 mL混匀，超声30 min 过滤，取20 mL 续滤液低温挥干，加10 mL 甲醇溶解残渣，过0.22 μm 有机滤膜备用。

1.3.2 色谱条件

槟榔中生物碱的HPLC 色谱图见图1。

图1 槟榔中生物碱的HPLC 色谱图

1.4 数据分析

用Origin 8.0 对处理数据并作图，使用SPSS 28.0 完成聚类分析与主成分分析统计。

2 结果与分析

2.1 方法学考查

2.1.1 线性关系、检出限和定量限

取混合对照品溶液适量，50%甲醇进行梯度稀释。分别精密吸取上述混合对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。将混合对照品溶液用甲醇-水溶液逐级稀释，分别进样测定，至信噪比S/N=10 时定为定量限，信噪比S/N=3时定为检测限。

生物碱分析的线性关系、定量限和检测限见表1。

表1 生物碱分析的线性关系、定量限和检测限

2.1.2 精密度

取一定浓度混合对照品溶液，连续进样6 次考查日内精密度，槟榔次碱、去甲槟榔次碱盐酸盐、氢溴酸槟榔碱及去甲槟榔碱峰面积RSD 分别为0.409%，0.640%，0.150%，0.270%。取一定浓度混合对照品溶液，连续进样6 d 考查日间精密度，槟榔次碱、去甲槟榔次碱盐酸盐、氢溴酸槟榔碱以及去甲槟榔碱峰面积RSD 分别为3.386%，3.260%，0.470%，0.500%。因此，日内、日间精密度RSD 均低于5.000%，说明仪器测试结果符合测试要求。

2.1.3 重复性和稳定性

平行制备6 份供试品溶液，考查重复性。结果显示，槟榔次碱、去甲槟榔次碱盐酸盐、氢溴酸槟榔碱以及去甲槟榔碱峰面积RSD 分别为2.686%，4.930%，1.995%，4.400%，表明方法重复性良好。取同1 份供试品溶液分别在0，2，4，12，16，24 h分别进样，考查日内稳定性，槟榔次碱、去甲槟榔次碱盐酸盐、氢溴酸槟榔碱以及去甲槟榔碱峰面积RSD 分别为3.434%，4.835%，2.560%，4.592%。表明24 h 内稳定性满足测试要求。

2.1.4 回收率

取槟榔饮片粉末9 份，每份约0.25 g，精密加入3 个水平（80%、100%和120%） 的混合对照品溶液，每个水平制样3 份，进样测试加标回收率。生物碱回收率范围均在86.900%~118.191%，RSD（%）均小于3.000%，表明该法回收率良好。

槟榔饮片中4 种生物碱的回收率（μg/mL，n=3）见表2。

表2 槟榔饮片中4 种生物碱的回收率（μg/mL，n=3）

2.2 前处理加工工艺过程中生物碱含量变化规律

为避免槟榔鲜果污染及腐坏，一般选择在槟榔产地进行剥皮、煮洗、清洁及干燥过程。经在广西等地实地探访产地初加工过程后，综合当地温度、湿度等条件，选择煮洗温度40 ℃，干燥温度45 ℃及Na2CO3浓度为基础条件，分别浸泡煮洗槟榔鲜果30，50，70，90 min，煮洗后晾晒干燥30，40，50，60 min，清洗槟榔表面油脂的Na2CO3浓度为0，0.25，0.30，0.35，0.40 mol/L。

槟榔样本前处理工艺中生物碱质量浓度测定结果（μg/mL） （n=3） 见表3。

表3 槟榔样本前处理工艺中生物碱质量浓度测定结果（μg/mL） （n=3）

由表3 可知，①槟榔中生物碱质量浓度顺序为槟榔碱>去甲基槟榔碱>去甲基槟榔次碱>槟榔次碱；②未经处理的槟榔果的生物碱中槟榔碱含量最高，且在40 ℃下煮洗90 min，烘干30 min，并使用0.35 mol/L Na2CO3溶液清洗时槟榔碱的含量最高，去甲基槟榔碱趋势一致；③干燥过程导致槟榔碱的损失最严重，在45 ℃下干燥60 min，煮洗50 min，并使用0.25 mol/L Na2CO3溶液清洗时槟榔碱的含量相对较低；④其次为煮洗工序，在40 ℃下煮洗50 min，烘干60 min，并使用0.25 mol/L Na2CO3溶液清洗时槟榔碱的含量均最低（见图2）。由于槟榔生物碱是水溶性物质，浸泡煮洗槟榔鲜果，导致生物碱溶于水中造成损失，以煮洗30 min 为参照，煮洗过程中槟榔碱最高损失达到4.39%，而干燥过程加速了槟榔碱的挥发损失，以干燥时间（45 ℃） 30 min 为参照，槟榔碱损失率达到72.5%。但槟榔碱在Na2CO3溶液中溶解度降低，进而减小了槟榔碱的损失，显示出槟榔碱质量浓度的峰值1 803.288±118.966 μg/mL；⑤槟榔次碱、去甲基槟榔碱及去甲基槟榔次碱在各工艺下的变化趋势与槟榔碱几乎一致。

图2 槟榔前处理工艺中4 种生物碱质量浓度变化规律

槟榔前处理工艺中4 种生物碱质量浓度变化规律见图2。

2.3 多元统计分析

2.3.1 聚类分析

在SPSS 28.0 软件中将16 批槟榔样品的4 种质量浓度测定结果进行标准化运算，以标准化得分为变量进行系统聚类分析，选用组间联接，度量标准选用“平方欧式距离”得到树状图。图2 中“0~25”的标度是将各类检测对象的不同评价指标按统一尺度映射后的结果。

槟榔不同前处理工艺聚类分析树状图见图3。

图3 槟榔不同前处理工艺聚类分析树状图

由图3 可知，当标度为10 时，将12 个前处理工艺所得样本聚为3 类：煮洗时间30，50，70 min归为第一类，槟榔碱与总生物碱含量均较低，可见前处理工艺中的煮洗时间对槟榔生物碱含量的损失影响较高；Na2CO3浓度0，0.35 mol/L，煮洗90 min聚为第二类，样品中所含槟榔碱质量浓度较高，槟榔次碱、去甲槟榔次碱、去甲槟榔碱含量相似且远低于槟榔碱。第三类为干燥时间30，40，50 min 和Na2CO3浓度0.25，0.30 mol/L 处理样本，其中槟榔碱含量高，数值接近，且为主要生物碱成分；干燥时间各参数下样本分别分布在两类中，且对生物碱损失影响较低。综上所述，前处理加工工艺中煮洗时间对槟榔中生物碱质量浓度的影响程度高于干燥时间及Na2CO3清洗溶液浓度。

2.3.2 主成分分析

对16 批槟榔样品进行主成分分析（PCA），提取出3 个主成分，贡献率分别为75.4%，21.7%和2.9%，主成分累计贡献率达到97.1%，因此这2 个成分已足够对前处理工艺中生物碱质量浓度进行评价。主成分1 以Na2CO3浓度影响为主，干燥时间影响为辅；主成分2 以干燥时间影响为主、煮洗时间为辅。提取3 个成分做得分图，可见分类结果与聚类分析的分类结果一致，说明各前处理加工过程中4 种生物碱和质量浓度变化明显，且槟榔的煮洗和干燥过程对槟榔碱质量浓度变化具有较大影响。

主成分得分图见图4。

图4 主成分得分图

3 结论

槟榔食用和药用的历史悠久，其中4 类生物碱含量分布直接影响其药效活性。鲜果经过煮洗、去油、干燥等主要前处理加工工艺后得到要用槟榔产品。选取鲜果槟榔为研究对象，基于HPLC 技术建立了鲜果槟榔及初加工后槟榔样本中4 类生物碱的分析方法，考查了槟榔前处理加工工艺下4 种生物碱的含量变化规律。结果表明，4 种生物碱中槟榔碱为主要成分，含量普遍较高，可高达1 803.288±118.966 mg/kg，其余成分含量分布为槟榔碱> 去甲基槟榔碱> 去甲基槟榔次碱> 槟榔次碱；经处理加工后的生物碱存在一定损失，其中煮洗工艺影响程度> 干燥工艺> Na2CO3溶液清洗工艺。但在40 ℃下煮洗90 min，烘干30 min，并使用0.35 mol/L Na2CO3溶液清洗时槟榔碱的损失量最小；而在45 ℃下干燥60 min，煮洗50 min，并使用0.25 mol/L Na2CO3溶液清洗时槟榔碱的损失最高可达72.5%。根据4 种生物碱含量的变化规律，经统计分析发现前处理工艺主要分为2 类：煮洗工艺和其他工艺。

研究了槟榔从鲜果到成品加工过程中4 种生物碱的含量变化特征，并找出对各成分有显著影响的加工工序，为药用槟榔饮片的成分研究及药效品质评价提供科学依据。