玉米基质下枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵代谢特征研究

曹运成，鲁 平，李宜诺，代孟丽，郑云娇，冯 凡

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000）

发酵工艺是现代生物工程中的一项以旧改新的技术。利用不同微生物之间的互相影响，应用多种微生物之间的高效发酵功能，为社会提供更多高质量食品或将微生物直接应用于工农业生产中[1]。迄今为止，人类对发酵工艺的研究脚步从未停止，孜孜不倦地致力于提高微生物和一些食物残留物的利用率，不断增加各种产品的生产效率，使发酵产品的工艺更加简单、更加节约能源等， 并寻求更好的方法将发酵这种方法应用到更广泛的领域[2]。发酵技术的一个重要应用是防止有机物的腐烂，另一个重要应用是使口味平淡的食品原料发生感官、物理和营养方面的变化，改善风味和口感，它在人类的饮食文化历史中有着重要的作用。近年来，我国发酵食品工业化水平逐年提高，白酒、酸奶等产品的工业化生产发展迅速，其他产品（如腐乳、发酵肠等）工业化程度相对较低。因此，提高我国传统发酵食品工业化水平，参与国际竞争很有必要。枯草芽抱杆菌属一类广泛分布在自然环境中的需氧型革兰氏阳性好氧菌。单个细胞长1.4~3.0 μm，菌落表面为粗糙的、不透明的微黄色，具有耐酸、耐盐易保存等特点[3]。由于枯草芽孢杆菌需靠氧气生长繁殖，所以会出现低氧环境，从而阻碍有害微生物的生长，并促进其他厌氧有益菌（如乳酸菌） 繁殖[4]。乳酸杆菌是一类杆状厌氧型革兰氏阳性菌，可发酵葡萄糖并产生大量乳酸，最适生存pH 值为5.5~6.0，在自然界中广泛存在[5]。枯草芽孢杆菌与乳酸菌共发酵将使发酵工艺更加简单、更加节约时间。两者均为不严格的好氧、厌氧菌，虽有矛盾，但可共存。枯草芽孢杆菌利用液体和发酵罐中的氧为乳酸菌的发酵提供缺氧环境，而同步发酵的乳酸菌能及时利用掉枯草芽孢杆菌糖化作用产生的还原糖，从而促进发酵，为进一步开展益生菌的共发酵食品开发奠定研究基础[4-5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：玉米粉。

试验菌株：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌。

试验试剂：葡萄糖标准品（AR），中国药品生化制品检定所提供；福林试剂（AR）、碳酸钠（AR）、硝酸铝（AR）、无水乙醇（AR）、亚硝酸钠（AR）、蛋白胨（BR）、牛肉膏（BR）、七水硫酸锰（AR）、氢氧化钠（AR），国药集团化学试剂有限公司提供；氯化钠（AR）、七水硫酸镁（AR），无锡市亚泰联合化工有限公司提供；酵母粉（BR），济南杰辉商贸有限公司提供；吐温-80（BC），上海国药试剂集团提供；葡萄糖（AR），北京奥秘佳得医药科技有限公司提供；乙酸钠（AR），东莞市勋源化工有限公司提供；柠檬酸氢二胺（AR），郑州美孚化工产品有限公司提供；磷酸氢二钾（GR），郑州天之昊化工产品有限公司提供。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计，南京新飞达光电科学技术公司产品；恒温培养箱，联鲸精密仪器公司产品；pH计，杭州美控自动化技术公司产品；离心机，力康发展公司产品；电子天平，上海赞维衡器公司产品；高压蒸汽灭菌锅，盛科信德科技公司产品；层流洁净工作台，安泰空气技术公司产品；恒温水浴锅，常州市亿能实验仪器厂产品；恒温振荡摇床，常州梅香仪器公司产品；全自动氨基酸分析仪，阳奇特尔科技公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备

（1） DNS 试剂。酒石酸钾钠18.2 g，溶于50 mL蒸馏水加热，再依次加入3,5 -二硝基水杨酸0.03 g，氢氧化钠2.1 g，苯酚0.5 g，搅拌溶解，冷却后蒸馏水定容至100 mL，装入棕色瓶中避光保存[6]。

（2） 0.9%生理盐水。电子天平称量1.8 g 固体氯化钠，将其充分溶解在200 mL 蒸馏水中，于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

（3） 12%Na2CO3。先称量12 g 的Na2CO3，将其充分溶解在100 mL 蒸馏水后定容至容量瓶中，即可得质量分数为12%的Na2CO3溶液。

（4） 10% Al(NO3)3。准确称量10 g 的Al(NO3)3，溶解移至100 mL 容量瓶中定容。

（5） 1 mol/L NaOH。准确称量4 g 氢氧化钠固体，待完全溶解后，冷却至室温后玻璃棒引流定容至100 mL 容量瓶中。

1.3.2 培养基的制备

（1） MRS 液体培养基。蛋白胨5 g，牛肉浸取物（牛肉膏） 5 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖10 g，乙酸钠2.5 g，柠檬酸氢二胺1 g，吐温-80 0.5 mL，磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁0.1 g，七水硫酸铀0.025 g，蒸馏水500 mL，调节pH 值6.2~6.4；于121 ℃下高压蒸汽灭菌15 min[7]。

（2） LB 液体培养基。酵母粉1.0 g，胰蛋白胨2 g，氯化钠2 g，蒸馏水200 mL，调节pH 值7.3 左右，于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

（3） 发酵培养基。取玉米粉5 g 于100 mL 蒸馏水中，自然pH 值，摇晃均匀，于115 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

1.3.3 方法

（1） 菌种活化。于无菌操作台中，从微生物培养平板中用接种环挑取枯草芽孢杆菌单菌落于LB 液体培养基中37 ℃下以转速180 r/min 振荡培养直至菌液光密度为20，将乳酸杆菌接种于MRS 液体培养基中，于37 ℃下以转速180 r/min 振荡培养直至菌液光密度为5，备用[8]。

（2） 混菌发酵。分别从2 种活化菌液中用移液枪移取1 mL 的枯草芽孢杆菌菌液和乳酸杆菌菌液于发酵培养基中，于37 ℃下以转速180 r/min 振荡培养，每隔24 h 取样检测[9]。

（3） 还原糖的检测。取6 支15 mL 试管分别加入葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，每支试管补加蒸馏水至1 mL 后，各试管中添加DNS试剂2 mL，沸水浴2 min，流水冷却，蒸馏水补至15 mL；于波长540 nm 处测其吸光度，制作标准曲线。

还原糖标准曲线见图1。

图1 还原糖标准曲线

发酵液中葡萄糖含量的测定：取适量样品于离心管中，于4 ℃下以转速8 000 r/min 离心10 min，取上清液用于还原糖测定。用DNS 比色法[10]测定葡萄糖的含量（与葡萄糖标准曲线的制作的方法一致，将葡萄糖标准液用样品上清液代替即可），将所测的吸光度代入葡萄糖标准曲线回归方程中，计算得葡萄糖含量。

（4） pH 值的检测。取发酵液2 mL 于烧杯中，加入18 mL 的0.9%生理盐水，充分搅拌溶解，pH仪测其pH 值[11]。

（5） 总酚的测定。取1 支规格为25 mL 的试管，依次加入20 mL 蒸馏水，2 mL 12%Na2CO3溶液，1 mL福林酚溶液，补加1 mL 样液定容至25 mL，避光1.5 h 后，于波长765 nm 处测其吸光度[12]。总多酚的标曲制作以吸光度为纵坐标，没食子酸的质量分数为横坐标。

总酚标准曲线见图2。

图2 总酚标准曲线

（6） 总酮的测定。取1 支15 mL 试管，加入0.5 mL的样品，再加入30%乙醇4.5 mL 和15%NaNO2溶液0.3 mL，反应6 min 后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL继续反应6 min 后，加入1 mol/L NaOH 溶液4 mL，用30%的乙醇定容至10 mL，反应15 min 后于波长510 nm 处以蒸馏水为对照，测其吸光度[13]。将数值代入标准曲线回归方程Y=0.313 9X+0.005 2，相关系数为0.999 2，计算得黄酮质量。

总酮标准曲线见图3。

图3 总酮标准曲线

（7） 氨基酸的测定。使用全自动氨基酸分析仪进行分析。其工作机理：样品中的氨基酸在pH 值较低时携带正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但其吸附强度不同，碱性氨基酸结合力最强，其次为中性氨基酸，酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、pH 值的缓冲液依次将氨基酸按不同吸附力进行洗脱。分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可被分光光度计检测的有色物质，随后于检测器中被检测出来[14]。

（8） 数据的处理。每组试验作3 个平行组，运用Excel 计算平均值和方差，并运用Origin 8.6 软件对发酵液数据作图。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵糖化率的变化

枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵糖化率的变化见图4。

图4 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵糖化率的变化

由图4 可知，发酵周期内糖化率呈上升趋势，在发酵96 h 前，其糖化率处于持续增长状态，说明其还原糖含量也在不断增多。96 h 后糖化率略有下降，发酵120 h 后发酵液中的还原糖含量基本稳定。

2.2 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵pH 值的变化

与发酵液的糖化率相对应，枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵的过程中会有一定量的乳酸积累，通过测定发酵液的pH 值加以研究。

枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌联合发酵的pH 值变化见图5。

图5 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌联合发酵的pH值变化

发酵216 h 过程中，其pH 值呈下降状态，说明发酵液的酸度不断增加。48 h 后发酵液pH 值大幅度下降，96 h 后其发酵的pH 值基本稳定在4.5 左右。

2.3 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵总酚变化

枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌混合发酵的总酚变化见图6。

图6 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌混合发酵的总酚变化

由图6 可知，发酵8 d 内发酵液中的总酚质量浓度始终处于上升趋势。在发酵第2~4 天及最后1 d其总酚的增长幅度最为显著，在发酵的第4~7 天其总酚质量浓度变化曲线较为平稳。酚类物质质量浓度在不同温度、不同蔗糖添加量和pH 值条件下也有所不同。此次发酵试验是在恒温条件下进行，随着发酵时间的推移，蔗糖不断分解为还原糖，蔗糖含量逐渐降低，酚类物质质量浓度也随之增加，通常在pH 值低于4 时，酚类物质质量浓度较低，由图5可知其发酵液最低pH 值大于4，因此发酵整体总酚质量浓度处于增长状态。

2.4 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵总酮的分析

枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌混合发酵的总酮变化见图7。

图7 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌混合发酵的总酮变化

由图7 可知，枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌混合发酵过程中，总酮质量浓度的变化趋势：发酵初始阶段黄酮质量浓度明显升高，之后增加较为缓慢，在120 h 后其总酮质量浓度仍缓慢增加，最后2 d 其总酮质量浓度分别为0.092 8，0.097 8 mg/mL 两者相差不大，总酮质量浓度基本趋于稳定。由陈玲等人[14]研究可知，在发酵过程中随着还原糖含量的不断增加，酒精含量也会不断增加，因此出现如图7 这种质量浓度变化是因为随着发酵时间不断推移，酒精含量不断增加；玉米粉中黄酮溶解量不断增加。其中影响酒精含量的因素有温度、枯草芽孢杆菌接种量、糖浓度等因素。由于试验在恒温环境下进行的，所以可以忽略温度对发酵液的影响，而枯草芽孢杆菌的接种量越多其发酵速度就越快，糖化率也就越高，从而导致酒精含量增加，使发酵液的总酮质量浓度增加。由于最后恒量玉米粉中的大部分黄酮已被萃取，使其黄酮的萃取趋于稳定。

2.5 枯草芽孢杆菌与乳酸杆菌共发酵氨基酸合成代谢分析

氨基酸峰面积变化图见图8。

图8 氨基酸峰面积变化图

取发酵样液2 mL 于离心管中，于4 ℃下以转速8 000 r/min 离心10 min 取上清液，使用针筒过滤器过滤放入冰箱保存，用于氨基酸的测定。其中要注意发酵液必须过滤以防止损坏机器，还需注意样液量必须为2 mL，以保证氨基酸检测仪顺利吸取样液。取发酵过程中具有代表性的3 d 进行分析。

由图8 可知，精氨酸、甘氨酸、赖氨酸含量在发酵过程中持续下降，胱氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸含量在不断升高，其中苯基丙氨酸含量最高。苯基丙氨酸、蛋氨酸、丙氨酸在72~96 h 期间峰面积的增长速度明显加快，在此阶段赖氨酸的峰面积下降速度明显加快；氨基酸的消耗可能与微生物的生长消耗有关，微生物滋生的越多，其氨基酸的消耗也就越多，这也侧面说明枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌在此时生长较旺盛。

3 结论

以玉米粉为基质，枯草芽孢杆菌与乳酸菌共同发酵后其糖化率、总酮、总酚含量不断增加，pH 值不断下降，基本稳定在4.5 左右，发酵液中除无色氨酸外，其余氨基酸基本含有，除微生物对氨基酸的消耗外，丙氨酸、赖氨酸、苯基丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸含量都较高，这2 种菌的共同发酵大大提升了其传统发酵工艺的速率，也提升了氨基酸的种类与含量，赋予了发酵食品更好的品质，更加值得在发酵工艺中推广。