一株杂色曲霉的分离筛选鉴定及其果胶酶的性质表征

冼莹莹

（梧州学院，广西 梧州 543002）

0 引言

果胶是半乳糖醛酸以α（1,4） 糖苷键连接而成的生物大分子化合物，主要来自植物[1]。果胶主要存在于植物细胞的胞间层和细胞壁中，对细胞的结构刚性和组织的柔性起重要作用[2]。果胶酶是一类降解果胶的酶，在果汁的制作中加入果胶酶可以降解果胶，促进水果组织的碎化，促进细胞的崩解，释放细胞内物质，增加营养促进人体吸收，增加果汁的流畅度和均一性等，因而是果汁生产中的关键酶[3]。

现在已有将果胶酶应用于实验室规模生产不同水果果汁的报道，然而，目前报道的果胶酶较少，难以满足不同的工艺需求。例如，安玉红等人[4]生产刺梨果汁所用的pH 值和温度分别为3.5 和45 ℃，唐杰等人[5]研究桑椹和杨梅果汁生产所用的温度为35~40 ℃，卢薇[6]研究蓝莓果汁生产所用的pH 值和温度分别为3.02 和60 ℃，郭凯华等人[7]研究制作沙棘果汁所用的温度为45 ℃，赵世民等人[8]研究制作火龙果果汁所用的温度为35 ℃，潘嫣丽等人[9]研究制作番茄-西番莲复合果汁所用的温度为50 ℃等。可见水果的品种不同，其酸碱度不同，其细胞壁结构也有差别，因而需要不同的生产条件，这就要求有更多具备不同性质的果胶酶以供选择。

土壤中含有丰富的微生物资源，采集了不同的土壤样品，分离其中潜在产果胶酶的微生物，并对菌株产的果胶酶进行酶学性质表征，以期为果汁工业的生产提供新的备选方案。

1 材料与方法

1.1 材料

土壤采集自梧州市，香蕉产自梧州市万秀区夏郢镇，橘子皮为购自药店的粗制陈皮粉碎后过60 目筛子。扩增真菌内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS） 使用诺维赞的2×Phanta 系列试剂，用于测定酶活力的底物果胶购自上海源叶公司，其他所用化学药品均为分析纯。

1.2 菌株分离和筛选

将土壤分散于灭菌水中，置于摇床中10 min 使颗粒分散，以释放内含的微生物。将分散液用灭菌水以10 倍为梯度进行系列稀释，各梯度稀释液涂布于分离培养基平板上，于30 ℃下培养5 d。平板上生长的真菌接种至筛选培养基中，在温度30 ℃和转速200 r/min 的摇床中培养5 d，其培养液以转速10 000 r/min 离心2 min，得到的上清液即为粗制果胶酶。测定上清液中的果胶酶活力，获得能产果胶酶的菌株，而后进行物种鉴定。

分离培养基的配方见文献[10]，所不同的是将文献中的淀粉换为橘子皮粉；不含凝固剂（琼脂粉）的分离培养基即为筛选培养基。以分析真菌ITS 序列的方式鉴定物种，操作依照文献[10]。察氏培养基的配方见文献[11]，培养温度为30 ℃。

1.3 果胶酶活力测定

采用DNS 法测定果胶酶活力（聚半乳糖醛酸含量为0.5%，若无说明则为50 ℃下反应10 min），其试剂配方、反应体系和操作均按照文献[10]。以半乳糖醛酸作为标准物建立标准曲线，1 个单位的酶活力定义为：每小时释放出相当于1 mg 半乳糖醛酸所需要的酶的量。

1.4 酶学性质测定

首先考查最适pH 值，即为果胶酶在不同的pH 值中（0.5 个单位为间隔） 的酶活力；再考查最适温度，即为在最适pH 值下，果胶酶在不同温度中（5 ℃为间隔） 的酶活力。将最高者设定为100%，其余pH 值（或温度） 下的酶活力折算为相对百分比。

温度耐受性为将果胶酶置于不同温度（5 ℃为间隔） 下保温1 h 后测定其残余酶活力。将没有进行处理的原酶液的酶活力设定为100%，其余温度下的酶活力折算为相对百分比。

1.5 香蕉果汁制作

将香蕉去皮，果肉用小刀切碎后放入榨汁机，加入3 倍体积的水后粉碎半分钟获得果浆。在果浆中加入等体积果胶酶后置于50 ℃下过夜作为处理组，以加水替代果胶酶作为对照组。处理完毕后将混合物以转速3 000 r/min 离心1 min，所获得的上清液则为果汁。同时以DNS 法测定上清液中的还原性物质（以半乳糖醛酸计）[12]。

2 结果与分析

2.1 微生物的分离、筛选与鉴定

从7 份土壤样品中分离得到5 株在分离培养基平板上菌落形态各不相同的丝状真菌菌株，然而在液态培养时，仅发现菌株XYYWZSP1 的培养液中有果胶酶活力，其活力为1.67±0.08 U/mL，因而选取该菌株进行后续研究。

菌株XYYWZSP1 在察氏培养基平板上的菌落形态见图1。

图1 菌株XYYWZSP1 在察氏培养基平板上的菌落形态

由图1 可知，该菌株在察氏培养基平板上生长的新生菌丝为白色，随着时间延长分化出分生孢子导致颜色慢慢变灰。培养5 d 后，圆形菌落的中心区域为灰绿色，中圈区域为灰色，外围新生菌丝为白色。该菌的生长速度不快，生长5 d 后其菌落直径仅0.5 cm。未见色素产生。将其内转录间隔区搜寻NCBI（BLASTN 命令），结果发现其与多株杂色曲霉（Aspergillus versicolo）r 一致性较高，因此该菌株应为杂色曲霉。

杂色曲霉一直以来都是以产次级代谢产物而著称，近年来有多项研究报道杂色曲霉能产生生物碱、萜类、聚酮等结构多样的次级代谢产物，有统计达325 种[13]，这些产物表现出抗病原菌、抑制鼻咽癌细胞和肺癌细胞（H1299 和H520） 等活性[14]。然而，迄今没有报道杂色曲霉产果胶酶的情况，因此研究能拓宽人们对该物种的认识。

2.2 果胶酶的酶学性质

pH 值对果胶酶活力的影响见图2，温度对果胶酶活力的影响见图3，温度对果胶酶稳定性的影响见图4。

图2 pH 值对果胶酶活力的影响

图3 温度对果胶酶活力的影响

图4 温度对果胶酶稳定性的影响

由图2 可知，该果胶酶在pH 值4.5 时酶活力最高，并且在pH 值4.0 时的酶活力也接近最高酶活力，说明该酶是酸性酶。很多水果的pH 值很接近该酶的适宜pH 值，例如有报道指出芭蕉、火龙果和芒果果汁的pH 值分别为4.71，4.56，4.52。虽然香蕉的pH 值为5.17[15]，但该果胶酶在pH 值5.0 时仍能发挥出80%的酶活力。该果胶酶在50 ℃下的酶活力最高，这与工业果汁生产使用的温度相同[16]；该果胶酶在55 ℃的酶活力次之，能发挥出90%的酶活力（见图3）。该酶在35 ℃下比较稳定，保温1 h 后酶活力无损失（见图4）。随着保温温度的提高，其热稳定性变差。

2.3 果胶酶用于香蕉果汁

果胶酶水解香蕉果汁见图5。

图5 果胶酶水解香蕉果汁

由图5 可知，由于在企业生产果汁的时候难以实现高速离心，为了更接近企业的评价标准，采用的离心条件为转速3 000 r/min 下离心1 min。当等体积水加至等体积香蕉果汁中时，温浴时间到后离心，可以看出香蕉果浆有大量絮状沉淀。但当等体积该菌株的果胶酶与等体积果汁混合后，温浴时间到后离心，其沉淀的量明显少于对照组，并且其沉淀的质地的对照组致密，没有絮状沉淀，说明香蕉果汁中的胶质已经被该果胶酶水解。胶质的水解对工业有重要意义，意味着可以降低果汁黏度，增加流动性，降低压榨成本和增加果汁产率[16]。相关研究报道，使用果胶酶后香蕉果汁的产量提升幅度不一，这已被证实是与香蕉的栽培种和成熟的程度有关——不同栽培品种和不同成熟程度的香蕉，其细胞壁结构存在较大差异，这些差异直接影响果胶酶的水解效果[15]。处理组的果汁产率比对照组增产了30.23%±1.89%，效果非常明显，说明该菌株果胶酶是有用的。

在还原性物质方面，对照组中含量为23.01±0.20 g/L，处理组中含量为26.67±0.07 g/L，增产率为15.85%±0.36%。在已有的研究中少有测定还原物质的增产情况[17]，但该项指标是有必要测定的，因为还原性物质的增加可以清晰指示果胶酶的效果，原因有2 个：①果胶是单条链的长链分子，具有1 个还原性末端，果胶酶在果胶链中每次水解后释放出的产物为2 个果胶寡聚物，使得还原性末端变为2 个；②如果果胶酶能够使细胞崩解，就能释放出细胞内的物质，而细胞内的物质中亦有还原性物质（如果糖、葡萄糖等），同样提升了可测定得到的果汁中的还原性物质的量[16]。研究所得的增产率十分明显，也从另一个方面说明该菌株果胶酶是有用的。

香蕉是一种深受人们喜爱的、芳香、清甜、并且富有营养的水果[18]，然而容易腐烂，特别是在采收期集中上市时会有滞销、腐烂，造成变相减产的情况，上述研究为果汁可打开一条新的销路，起到助农的作用[19]。虽然有报道个别杂色曲霉菌株可能产生毒素[20]，导致该物种是否能直接用于食品工业中还存在担忧，但下一步研究或可应用基因工程方法专一性地将相关的基因克隆出来，转到生物安全的物种中表达，可以更低廉的成本安全大量生产获得目标产物[21]。总之，经过试验验证，该株真菌产生的果胶酶可以在香蕉果汁的生产中发挥作用，或能助力农业发展。

3 结论

从采集自梧州的土壤样品中分离获得了一株产果胶酶的丝状真菌，并将其鉴定为杂色曲霉。对其液体培养产的粗果胶酶的酶学性质进行了测定，得知其为酸性酶。后续将该果胶酶应用于香蕉果汁的实验室生产。试验结果表明，该果胶酶可明显促进香蕉果汁的增产，说明该菌株所产果胶酶或能成为果汁生产的候选酶。